نموذج الجرذ المعتمد على قناة لمفاوية عنق الرحم لتقييم نقل الجهاز اللمفاوي من الرأس والدماغ

يفحص مشروعنا كيف ترتبط اللمفاوية الدماغية بأمراض الجهاز العصبي المركزي مثل الزهايمر، والسكتة الدماغية، والالتهاب العصبي، من خلال تحديد المواد التي تخرج من الدماغ. كانت الطرق الحالية تفتقر إلى بروتوكول ونهج موثوق لأخذ عينات نظرية وقياس تدفق اللمفاوات المستخرج من CNS، وهو ما يمكن من خلال هذا البروتوكول. للبدء، قم بتحميل حوالي 0.7 ملليلتر من محلول مضاد التخثر المخفف مسبقا في حقنة أنسولين معقمة بسعة ملليلتر واحد باستخدام إبرة قياس 30 لتغطية السطح الداخلي لقنية البولي إيثيلين.

احتفظ بالحقنة المحملة مسبقا تحت ظروف معقمة حتى الاستخدام. لتحضير القنيولات، استخدم أنابيب بقطر خارجي 0.5 مليمتر وقطر داخلي 0.3 ملم لكل من القسمين النهائيين، وأنابيب بقطر خارجي 0.6 ملم وقطر داخلي 0.5 ملم للقسم الأوسط. باستخدام المقص، قطع مقاطع القنية إلى أطوال سنتيمترين للجزء القريب المتصلة بإبرة المحقنة، و40 سنتيمترا للجزء الأوسط، وثمانية سنتيمترات للجزء البعيد المخصص للقنين.

قم بتجميع القنية بتكوين من الرأس إلى الذيل. ثم يقطع ويميل الطرف البعيد لمجموعة القنية بزاوية تقارب 45 درجة لتسهيل الإدخال السلس في القناة اللمفاوية العنقية. تحقق من كفاءة كل قنية عن طريق توصيل الحقنة المحملة مسبقا بالطرف القريب من القنية المجمعة.

أطلق كمية صغيرة من المحلول بلطف لغسل الكانيولا. تأكد من خروج المحلول بسلاسة من الطرف البعيد دون وجود دليل على التسرب. ضع فأر مخدر مستلقيا على وسادة جراحية مدفأة تحافظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية.

قم بإمالة الرأس ومدد الرقبة باستخدام وسادة دعم صغيرة إذا لزم الأمر، لزيادة تعرض منطقة عنق الرحم. قيد الأطراف الأمامية بلطف باستخدام أربطة مطاطية أو أشرطة جراحية لتقليل الحركة. اشطف الفراء فوق منطقة عنق الرحم بمحلول ملحي عادي معقم لتسهيل الحلاقة.

ثم حلق كامل موقع الجراحة جيدا لضمان إزالة الفراء بالكامل قبل الشق. حدد موقع الجراحة برسم خط منقط بطول 2.5 سنتيمتر لتأكيد طول الشق الأولي. ضع الطرف العلوي من الشق على بعد حوالي سنتيمتر إلى 1.5 سنتيمتر أسفل الشفة السفلية.

بعد التأكد من عمق التخدير عبر رد فعل قرص إصبع القدم، قم بشق الطبقة السطحية من عضلات عنق الرحم بعناية على طول الخط المحدد. ثم افصل بلطف الطبقات العضلية المتبقية، وخاصة اللفافة العنقية السطحية، لكشف الشريان العنقي. اسحب عضلة القص والغدة تحت الفك السفلي ووجهها بعيدا عن المجال الجراحي لتسهيل تحديد القناة اللمفاوية العنقية.

استخدم موسع الأنسجة للحفاظ على نافذة الجراحة. باستخدام مسحة قطنية، أوقف الأنسجة العضلية جانبا مؤقتا أثناء تحديد موقع العقدة اللمفاوية والقناة اللمفاوية المرتبطة بها. حدد موقع القناة اللمفاوية العنقية العتامة عديمة اللون التي تمتد بالتوازي مع الشريان السباتي.

باستخدام ملقط غير حاد، مرر بلطف عبر الأنسجة الضام المنفصلة وحافظ على ملقط في مكانه. عزل القناة اللمفاوية العنقية بعناية عن الأنسجة الضامة والدهنية المحيطة عن طريق التشريح السطحي. ثم قم بعمل شق صغير في النصف العلوي من الوعاء المكشوف.

يمكن إنشاء ثقب جلدي ثانوي صغير يبعد حوالي 1.5 سنتيمتر عن نافذة الجراحة ليكون نقطة تثبيت إضافية للكانيولا. أدخل القنية من خلال الفتحة الثانية، وامسك طرفها البعيد بالملاقط، وتأكد من توجيه وجهها المشطوف للأعلى. ثم أدخل الطرف البعيد بلطف حوالي مليمترين داخل القناة اللمفاوية عبر الشق، موجها نحو الرأس.

راقب الطرف القريب من القنية لمدة دقيقة إلى دقيقتين. تأكد من نجاح القناة من خلال مراقبة تدفق بطيء وثابت للسائل اللمفاوي. ثبت القنية بوضع قطرة صغيرة من لاصق الأنسجة السيانوأكريلات مع ماصة في موقع الشق وفتحة التثبيت الثانوية.

راقب تدفق اللمف لعدة دقائق للتأكد من تدفق مستمر. ثم أزل موسع الأنسجة بعناية، وأعيد وضع الغدة تحت الفك السفلي إلى موقعها الأصلي. قم بتثبيت أنبوب طرد مركزي دقيق مغطى بمضادات التخثر وموسوما مسبقا في الطرف البعيد للكانيولا.

ثم أعد وضع جميع طبقات العضلات إلى مواقعها الأصلية، وأغلق الشق الجلدي بالغرز و/أو لاصق الأنسجة. اجمع اللمفاوف باستمرار في أنابيب الطرد المركزي الدقيق المغطاة بمضادات التخثر، واستبدل الأنابيب على فترات محددة مسبقا، عادة كل ساعة. تأكد من بقاء الفأر مخدرا طوال فترة التجميع.

خزن العينات المجمعة مع أكياس الثلج في صندوق تبريد. تراوحت معدلات تدفق اللمفاوي كل ساعة على مدى فترة جمع مدتها ست ساعات في الفئران التي تم تعليبها بنجاح بين 0.09 إلى 0.13 ملليلتر في الساعة. في الفئران السليمة، ظل النقل اللمفاوي التراكمي للألبومين المميز بالتريتيوم داخل المخطط ضئيلا خلال الساعتين الأوليين وارتفع بشكل كبير بعد ذلك.

أظهرت مقارنة تركيزات الألبومين الموسومة بالتريتيوم بين اللمفاوف والبلازما اختلافات في التركيزات مع مرور الوقت في الفئران السليمة. ارتبط الالتهاب العصبي الناتج عن إعطاء الإشريكية القولونية لبوليسكاريد بين الصفاق بانخفاض طفيف في معدل تدفق اللمفاوي الكلي خلال ثماني ساعات وانخفاض يقارب الضعف في نسبة الجرعة الكلية المنقولة إلى اللمف. أظهرت نسبة تركيز اللمفاوف إلى البلازما عدم وجود فرق كبير بين الفئران السليمة والجرذان الملتهبة عصبيا، مما يشير إلى تشابه في ملفات تنظيف اللمفاوية العنقية.

مكن هذا البروتوكول من أخذ عينات بيولوجية مباشرة من اللمفاوف المشتقة من الدماغ، مما جمع بين التصوير الخارجي غير المباشر أو الطريقة الراتنجية مع تدفق الجهاز العصبي المركزي القابل للقياس. يتيح البروتوكول دراسة إزالة الأدوية التي تدار مركزيا عبر المسارات اللمفاوية، مما يسمح بقياس مسارات التصريف ومعدلات التصريف. يمكن للدراسات المستقبلية دراسة كيفية تنبيه حالات مرض الجهاز العصبي المركزي إلى التنظيف اللمفاوي واستخدام هذه المعرفة لتحسين الأدوية التي تعيد وظيفة الجهاز اللمفاوي في الدماغ.