رسم خرائط مناعة الرضع بأقل قدر ممكن من المدخلات: التحليل التكاملي للخلية الواحدة ومتعدد الأدوار

تحدد أبحاثنا كيف تتكيف المناعة في مرحلة العمر المبكر بعد الولادة باستخدام التحليل الطولي عالي الأبعاد متعدد الأبعاد من أحجام دم صغيرة. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على دراسات حديثي الولادة والأطفال لتحديد التنميط المناعي الطولي من عينات حيوية محدودة عبر الصحة والعدوى والالتهابات. للبدء، قم بإذابة قارورة تحتوي على خلايا دم حمراء رضيع متحللة بسرعة في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.

انقل الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي بسعة 15 ملليلتر يحتوي على 10 ملليتر من وسط RPMI دافئ كامل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. قم بطرد المركزي بالأنبوب بحرارة 400 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تخلص من السوبرناتينت. أعد تعليق حبيبة الخلية في ثلاثة ملليلتر من وسط RPMI كامل وعد العدد الإجمالي للخلايا.

قم بتخفيف العينة إذا كان التركيز مرتفعا جدا بحيث لا يمكن عدها. بعد عد الخلايا، كرر خطوة الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا في وسط RPMI كامل للحصول على تركيز مليون خلية لكل ملليلتر. انقل 100 ميكرولتر يحتوي على 0.1 مليون خلية إلى كل بئر من صفيحة قاع V بسعة 96 بئرا.

قم بطرد مركزي على اللوح عند 764 جرام لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. تخلص من السوبرناتانت. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولتر من مخزون الصبغة الحية الميتة مخففة من واحد إلى 2000 في PBS مع تخفيف كتلة FC وكتلة ومونوسيت من واحد إلى 100 إلى جميع العينات باستثناء العنصر غير المصبوغ.

حضن العينات لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. لغسل الخلايا، أضف 100 ميكرولتر من PBS. قم بعمل الطرد المركزي في الطبق عند 764 جرام لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية، ثم تخلص من الفائق بعناية.

أضف 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة السطحية، مخفف من واحد إلى 200 في فرز الخلايا المنشطة بالفلورة، أو FACS، إلى جميع العينات باستثناء العينات غير المصبوغة. حضن لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم اغسل الخلايا ب 100 ميكرولتر من مخزن FACS، ثم استخدم الطرد المركزي، وتخلص من المادة الفائقة.

قم بتثبيت الخلايا بإضافة 100 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالديهايد إلى كل عينة. حضن الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام، ثم اغسل الخلايا مرة أخرى، وأعد تعليقها في 200 ميكرولتر من مخزن FACS. جهز خرز تعويض UltraComp كعناصر تحكم بلون واحد.

صبغ خرز التحكم أحادي اللون باستخدام نفس إجراء العينات، بما في ذلك التثبيت إذا كانت العينات ثابتة. أيضا، حضر فلورة بدون تحكم واحد أو FMO بنفس الطريقة. شغل العينات، وأدوات التحكم ذات اللون الواحد، وأدوات التحكم غير المصبوغة، وأدوات التحكم الفلورية ناقص واحد على مقياس تدفق تقليدي أو طيفي.

افتح FlowJo واختر العينة التي تهتم بها لتحليلها. قم بضبط البوابات باستخدام عناصر التحكم المناسبة في النمط المعياري وFMO. تقوم الكريات البيضاء باستخدام FSC مقابل SSC لاستبعاد الحطام، واختيار الخلايا حسب الحجم والحبيبات.

استبعد الدوبليت باستخدام FSCA مقابل FSCH. تغيب الخلايا الحية باستخدام صبغة قابلة للحياة لاستبعاد الخلايا الميتة. من الخلايا الأحادية الحية، تنقسم إلى خلايا لمفاوية سالبة CD33 وخلايا نخاعي إيجابية CD-33.

داخل الخلايا الموجبة ل CD33، حدد الخلايا الأحادية الموجبة ل CD14. ثم داخل الخلايا الإيجابية ل CD33، حدد الخلايا الشجرية الإيجابية CD14 وCD11C الإيجابية. الآن، بين الخلايا اللمفاوية سالبة CD33، تسير خلايا T إيجابية CD3 وخلايا قاتلة طبيعية إيجابية CD3.

داخل الخلايا التائية الموجبة ل CD3، حدد مجموعات فرعية إيجابية CD8 وإيجابية CD4 وحدد خلايا B سالبة CD3، سلبية CD56، وإيجابية CD19. للبدء، قم بإذابة قارورة واحدة من خلايا الدم الحمراء المحللة المحفوظة بالتجميد في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي بسعة 15 مليليتر يحتوي على 10 ملليلتر من وسائط الخلايا التائية وجهاز الطرد المركزي بوزن 430 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

تخلص من السوبرناتانت. بعد إعادة تعليق حبيبة الخلية بملليلتر واحد من PBS، أضف تسعة ملليلترات أخرى من PBS إلى العينة. قم بطرد المركزي في الأنبوب عند 430 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت.

عد الخلايا وقيم قابلية البقاء باستخدام استبعاد الأزرق التريباني. إذا كانت صلاحية الصلاحية أقل من 70٪، استخدم مجموعة إزالة الخلايا الميتة كما يلي. أولا، جهز محلول الربط مرة واحدة عن طريق تخفيف محلول مخزن المخزن ذو الارتباط 20x بماء مقطر مزدوج معقم.

أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من حبيبات إزالة الخلايا الميتة لكل 10 إلى قوة سبع خلايا إجمالية. اخلط جيدا وحضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع عمود الفصل المغناطيسي في الحامل المغناطيسي المناسب، مع أنبوب تجميع.

ثم أضبط العمود بالشطف ب 500 ميكرولتر من مخزن الربط 1x. ارفع حجم تعليق الخلية إلى 500 ميكرولتر مع مخزن ربط 1x. بعد استبدال أنبوب التجميع، قم بتطبيق تعليق الخلية على العمود واجمع تدفق التدفق في أنبوب الطرد المركزي الدقيق الجديد بسعة 1.7 ملليتر.

بعد ذلك، اغسل العمود مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من مخزن الربط واجمع تدفق التدفق في نفس أنبوب الطرد المركزي المجهري. قم بعمل الطرد المركزي على حرارة 300 جرام لمدة 10 دقائق ثم تخلص من السوبرناتانت. عد الخلايا وقيم القدرة على البقاء مرة أخرى باستخدام استبعاد الأزرق الترابيباني.

أليكوت 20,000 خلية صالحة في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.7 ملليتر. ثم قم بطرد المركزي بالخلايا بوزن 300 جرام لمدة 10 دقائق وإزالة السوبرناتانت. أعد تعليق الخلايا ب 40 ميكرولتر من PBS تحتوي على 0.04٪ BSA.

وأخيرا، ضع الأنبوب الذي يحتوي الخلايا على الثلج وأرسله فورا إلى منشأة النواة الجينومية لتكوين المكتبة والتتابع. اجمع نتائج التسلسل بصيغة مخرجات الرينجر. تمت معالجة عينات بقع دم مجففة من الرضع الخدج ومجموعة الضابطات.

وتم قياس التعبير الطبيعي للبروتين ل 92 بروتينا مرتبطا بالمناعة. كان تعبير جين تنشيط الخلايا اللمفاوية الثالث ومحول الغشاء المنظم للإشارة 1 أعلى بشكل ملحوظ في الدم المحيطي من الرضع الخدج عند عمر شهرين مقارنة بدم الحبل السري المحدد. تم استخدام استراتيجية شاملة لتحديد تجمعات كريات الدم البيضاء من عينات خلايا الدم الحمراء التي تحلل من خلايا الدم الحمراء.

داخل مجموعة الخلايا التائية، تم تمييز مجموعات فرعية إيجابية ل CD4 وإيجابية CD8. بعد الترشيح، تم التقاط أكثر من 120,000 خلية وتحليلها في مجموعة بيانات تسلسل حمض الريبونوكليك أحادي الخلية. حدد تحليل تقليل الأبعاد والتجميع 14 مجموعة خلوية مميزة.

تم توضيح تجمعات الخلايا بناء على جينات معبر عنها بشكل مختلف وعلامات خلوية معروفة. 12 من أصل 14 تجمعا كانت تتوافق مع سلالات الخلايا المناعية، بما في ذلك الخلايا التائية، والخلايا القاتلة الطبيعية، وخلايا B، وخلايا الناخاع، والعدلات. رسم بياني مقطعي مكدس يوضح النسبة النسبية للخلايا في كل مجموعة خلال أسبوع وشهر وشهرين من العمر.

تمكن هذه الدراسة من قياس التواقيع المناعية الخلوية والنقية والبروتيومية والوظيفية طوليا من عينات دم محدودة الحجم. يمكن للدراسات المستقبلية استخدام هذه الطرق لتحديد مسارات مناعية صحية وكشف الاستجابات المناعية غير المنظمة في الحياة المبكرة المرتبطة بالأمراض.