تقنية لتثبيت بروتينات الغشاء في الأقراص النانوية

يبرز هذا البروتوكول سير عمل إعادة تشكيل القرص النانوي القابل للتكرار مع إطار عمل طريقة مولد. المنظفات تزعزع استقرار بروتينات الغشاء. تدرك الأقراص النانوية التي تحتوي على MSPs والدهون البنية الطبيعية للتجميد الكهرومغناطيسي والتحليل.

ابدأ بإضافة مكونات الدهون المحضرة في الكلوروفورم إلى أنبوب اختبار زجاجي لتحضير خليط دهون بسعة 100 ميكرولتر وامزجه جيدا. تبخر الكلوروفورم تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين حتى يتم إزالة كل السائل. أضف حوالي مليليتر من n-بنتان بشكل قطري إلى أنبوب الاختبار الزجاجي وقم بتبخير المذيب باستخدام غاز النيتروجين للحصول على طبقة دهنية جافة وشفافة.

بعد فك غطاء الأنبوب، ضع الأنبوب في جهاز تجفيف الفراغ. قم بإخلاء المجفف والحفاظ عليه تحت الفراغ لإزالة أي مذيبات متبقية. ثم أزل طبقة الدهون من مجفف الفراغ وأضف 250 ميكرولتر من محلول منخفض الملح الخالي من المغسلات لترطيب طبقة الدهون، مما ينتج تركيزا نهائيا يبلغ 10 ملليغرامات لكل ملليلتر.

بعد إعادة تعليق الدهون، قسمها بالتساوي إلى أربعة أنابيب زجاجية. قم بسونيكس التعليق حتى تصبح شفافة وواضحة، مما يشير إلى نجاح تكوين الليبوسومات. ثم قم فورا بغسل مساحة الرأس لكل أنبوب بغاز النيتروجين وخزنها عند ناقص 80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

بعد تحويل خلايا الإشريكية القولونية BL21 إلى بلازميد MSP1D1، حاملا علامة 7-هيستيدين وتوسع الزراعة لاحقا. تحفز تعبير MSP بإضافة IPTG إلى تركيز نهائي 0.5 إلى مللي مولار واحد. ثم استمر في زراعة الخلايا على درجة حرارة 16 درجة مئوية لمدة 16 إلى 20 ساعة مع الرج.

قم بعمل الطرد المركزي في مزرعة البكتيريا عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الفائقة واحتفظ بحبيبة الخلية. ثم أعد تعليق الحبيبات المستخرجة من لتر واحد من الزراعة في 100 إلى 150 ملليلتر من محلول التحلل.

قم بتوحيد الشكل تماما حتى يتم تحقيق تعليق موحد بدون كتل ظاهرة. بعد ذلك، استخدم جهاز تعطيل الخلايا فوق الصوتية المبرد لتفكيك البكتيريا عند 35٪ من الطاقة مع دورات من نبضات مدتها ثلاث ثوان، تليها توقفات لمدة ست ثوان. استمر في السونيك حتى يصبح الليزات صافيا ولونه بني فاتح.

قم بعمل الطرد المركزي في الليزات عند 30,000 جرام لمدة 45 دقيقة عند أربع درجات مئوية، واجمع المادة الفائقة للخطوات التالية. بعد حضنة المادة الفائقة براتنج نيكل-NTA متوازن وغسل لإزالة الشوائب، قم بإخراج البروتين المستهدف باستخدام مخزن الإزالة وجمع الكسور المشوهة. استمر في جمع الكسور حتى ينخفض امتصاص الفلوت عند 280 نانومتر إلى أقل من 0.01.

ثم انقل الإيلوات المجمع إلى أنابيب غسيل الكلى، وقم بتحطيمه على مخزن الغسيل عند أربع درجات مئوية مع التحريك اللطيف طوال الليل. بعد الغسيل الكلوي، تركز المحلول باستخدام جهاز فائق الترشيح للحصول على تركيز نهائي من MSP يتراوح بين اثنين إلى خمسة ملليغرامات لكل ملليلتر. تزن حوالي 250 ملليغرام من الخرزات الحيوية داخل أنبوب طرد مركزي بسعة 50 ملليتر.

أضف 25 إلى 30 ملليلتر من الميثانول إلى الأنبوب. قم بتدوير الخليط جيدا أو لف الخليط في الظلام. بعد حضن الأنبوب عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة، تخلص من المادة الفائقة بحذر وكرر غسل الميثانول مرتين إضافيتين.

قم بغسيل مماثل بماء مقطر مزدوج ثلاث مرات، ثم أضف 25 إلى 30 ملليلتر من محلول منخفض وخالي من المغسلات إلى الخرز. اهز أو تدوير الأنبوب على طاولة دوارة لخلط واحتضانة، كما تم توضيحه سابقا. تخلص من المادة الفائقة وكرر خطوة توازن المخزن منخفض الملح ثلاث مرات لتجهيز الخرزات بالكامل.

قسم الخرزات الحيوية المنشطة بالتساوي إلى ثلاثة أنابيب طرد مركزية دقيقة بسعة 1.5 ملليلتر للاستخدام لاحقا. استرجع قطعة واحدة من مخزون الدهون المحضر مسبقا وذوبها. فورا، قم بعمل الطرد المركزي في الأنبوب بقوة 7,000 جرام لمدة خمس ثوان عند أربع درجات مئوية لجمع المحتويات في القاع.

قم بفحص الدهون فوق الصوتية في حمام ماء عند سعة 60٪ وراقب الوضوح ودرجة الحرارة كل خمس إلى عشر دقائق لمنع ارتفاع درجة الحرارة. استمر في التصويب حتى يصبح مخزون الدهون صافيا وشفافا. احسب الكمية المولية لبروتين الغشاء المستهدف باستخدام المعادلة المعروضة.

ثم حساب الأحجام المطلوبة من محاليل MSP ومخزون الدهون بناء على نسبة ستوكيومترية مولية للبروتين المستهدف إلى MSP إلى الدهون من واحد إلى خمسة إلى 250. اجمع الأحجام المقابلة من الدهون وMSP لتحضير خليط رئيسي بسعة 300 ميكرولتر وحضن على الثلج لمدة 10 دقائق. ثم أضف ببطء 50 ميكرولتر من الخليط إلى محلول البروتين المركز مع استخدام الماصات بلطف لضمان التجانس.

ثم ضع الخليط المدمج على الثلج لمدة ساعة، وقلب الأنبوب بلطف كل 15 دقيقة لخلط جيدا. الآن، خذ أليكوت واحد من الخرزات الحيوية المفعلة مسبقا واسحب المحلول المنخفض الملح المتبقي. أضف محلول البروتين إلى الخرزات وحضن المحلول مع التناوب في الظلام لمدة ساعة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

قم بطرد المركزي بالخليط عند 7,000 جرام لمدة خمس ثوان عند أربع درجات مئوية. انقل المادة الفائقة بحذر إلى مجموعة ثانية من الخرزات الحيوية التي تم استنشاق المحلول منخفض الملح منها. بعد خلط المحتوى جيدا بالعكس اللطيف، حضن في الظلام لمدة أربع إلى ثماني ساعات أو طوال الليل.

بمجرد أن يتم طرد المحلول البروتيني لفترة وجيزة، انقل المادة الفائقة إلى العدد الثالث من الحبيبات الحيوية المنشطة مسبقا. حضن الحوض مع تدوير عند أربع درجات مئوية في الظلام لمدة ساعة واحدة. بعد عملية طرد مركزية قصيرة، انقل المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف.

الطرد المركزي عند 17,000 جرام عند أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق لإزالة التراكم. بعد تنقية مركبات TASK2 النانوية بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم، قم بتجميع الكسور القصوى من المحلول الشفاف وركزها إلى تركيز نهائي للقرص النانوي TASK2 بين 1.2 إلى 1.5 ملليغرام لكل ملليلتر. للتحقق من تجميع القرص النانوي، قم بتحليل العينات باستخدام 12٪ SDS-PAGE وتأكيد وجود MSP وبروتين الغشاء المستهدف.

عرض ملف كروماتوغرافيا استبعاد الحجم قمتين رئيسيتين تتوافقان مع مركب القرص النانوي المجمع عند 15.1 ملليلتر وMSP الحر عند 18.0 ملليتر. أظهر قياس مناطق الذروة أن قمة القرص النانوي المجمعة كانت مساحتها 147.2. في المقابل، بلغت ذروة MSP الحرة مساحة 31.5، مما يعادل كفاءة تجميع 82.4٪ للبروتين المستهدف، وأكد MSP في SDS-PAGE دمجهما في مركب نانوديسك واحد.

يساعد هذا البروتوكول الباحثين على دراسة بنية البروتينات الغشائية باستخدام تكوين مصفوفة الأقراص النانوية. الجزء الأكثر تحديا هو تحسين نسبة بروتين الغشاء، MSP، والدهون. يمكن أيضا إجراء اختبارات وظيفية، ورنين البلازمونات السطحية، ومطياف الكتلة باستخدام هذا الإجراء.