نموذج إصابة نقص الأكسجين وإعادة الأكسجين في أمراض القلب البشرية التي تتجمع ذاتيا

تركز أبحاثنا على إيجاد طرق جديدة لمساعدة القلب على التجدد بعد الإصابة. لهذا، نقوم بتوليد عضويات قلبية ذاتية التجميع وإجراء دراسات نقص الأكسجين وإعادة الأكسجين. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لدراسة الاستجابة للإصابات، والتدخلات العلاجية لتعزيز التجدد، ويمكن استخدامه لنمذجة الأمراض الخاصة بالمرضى.

للبدء، استنشق وسط مواصفات الأديم المتوسط القلبي D1 وأضف محلول انفصال خلوي كاف لتغطية الخلايا المتوسطة الأديم القلبية متعددة القدرات المستخرجة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. ثم ضع الطبق في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. باستخدام ماصة، أضف حجما متساويا من وسط الأديم القلبي D2 إلى كل بئر، وقم بعمل الماصة بلطف للأعلى والأسفل لتحرير الخلايا الملتصقة، ثم نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بسعة 15 مليليتر.

باستخدام جهاز طرد مركزي، قم بإخراج الخلايا بحرارة 300 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الحبيبة في ملليلتر واحد من وسط مواصفات D2 المتوسط القلبي يحتوي على خمسة ميكرومولات IWP-2 و50 ميكروغرام لكل ملليلتر من حمض الأسكوربيك في RB ناقص ال RB. اخلط 10 ميكرولتر من تريبان بلو مع 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب دقيق.

عد الخلايا باستخدام طريقة العد المفضلة، ثم تخفيف الخلايا إلى تركيز 100,000 خلية لكل ملليلتر في وسط مواصفات الميزوديرم القلبي D2 مع إضافة ثيازوفين دقيقين للضغط. انقل تعليق الخلية إلى خزان كاشف بحجم مناسب. ثم، باستخدام ماصة متعددة القنوات، يتم صرف 100 ميكرولتر في كل بئر من صفيحة ذات 96 بئر منخفضة التثبيت جدا لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 10,000 خلية في كل بئر.

قم بتدوير الصفيحة على حرارة 500 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لتحفيز تكوين عضويات القلب البشرية في زراعة التعليق. راقب تكوين حبيبة خلوية كبيرة ومحددة جيدا في كل بئر. إذا لم تكن الحبيبة محددة، كرر الطرد المركزي.

بعد 24 ساعة، جهز 10 ملليتر من وسط D3 يحتوي على خمسة ميكرومولر IWP-2 و50 ميكروغرام لكل ملليلتر حمض الأسكوربيك بمقدار RB ناقص لكل لوحة. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 ميكرولتر من وسائط D3 إلى كل بئر دون إزالة أي وسائط موجودة. في اليوم التالي، أزل 100 ميكرولتر من وسائط D3 من كل بئر.

لتقليل خطر الشفط، قم بإمالة اللوح بزاوية 45 درجة وثبت الماصة متعددة القنوات بزاوية 90 درجة على جانب اللوحة. ضع الماصة بإحكام على جدار البئر واسحب ببطء. بعد إزالة الوسط، استبدله ب 100 ميكرولتر من وسط D4 يحتوي على خمسة ميكروموللار IWP-2 في RB ناقص الوسائد.

باستخدام ماصة بسعة 1,000 ميكرولتر مع قطع طرفها، انقل الأعضاء القلبية البشرية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.7 ملليتر. دع الأعضاء تغوص في قاع الأنبوب وأزل الوسط الزائد بلطف. أضف محلول ملحي محشو بالفوسفات لغسل الأعضاء مرة واحدة.

انتظر بضع ثوان حتى تغوص، وقم بإزالة الفائض من PBS برفق. بعد ذلك، أضف 4٪ بارافورمالديهايد لتثبيت الأعضاء العضوية وضع الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح بالتثبيت. ثم نقل العدد المطلوب من الأعضاء الثابتة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.7 ملليتر.

أزل المحلول المثبت واغسل الأعضاء ب PBS الذي يحتوي على 0.1٪ Tween 20. جهز محلول الأجسام المضادة الأساسي عن طريق تخفيف الجسم المضاد إلى التركيز المطلوب في محلول التلوين. باستخدام ماصة، أضف 50 إلى 100 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الأساسي إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق، لضمان تغطية العضويات بالكامل.

بعد الحضانة والغسلات اللاحقة، يتم حضن العينة بجسم مضاد ثانوي مخفف في محلول التلوين لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية على منصة هز. بعد الحضانة، قم بغسل التمارين كما هو موضح سابقا. بعد ذلك، باستخدام رأس ماصة مقطوعة، انقل الأعضاء إلى شريحة زجاجية مشحونة بالإيجابية.

أزل بلطف فائض PBS باستخدام Tween 20 وأضف بضع قطرات من وسائط التثبيت لتغطية الأورجينويدات. ضع غطاء غطاء فوق الأورغانويدات بعناية لتسويتها. ثم تابع إجراء المجهر الفلوري.

بعد حضنة الأعضاء الثابتة طوال الليل في السكروز بنسبة 30٪ عند أربع درجات مئوية، انقلها إلى قالب بلاستيكي وأضف قطرة صغيرة من مركب درجة حرارة القطع المثلى إلى القالب، بما يكفي لتغطية العضويات. باستخدام ملقط ناعم أو رأس ماصة، أعد وضع الأعضاء بلطف في المركب بحيث لا تتجمع وتكون بعيدة عن حواف القالب. ضع الأعضاء العضوية بالقرب من قاع القالب قدر الإمكان لتعظيم عدد العينات الموجودة في عملية تجميد واحدة.

ضع القالب في مبرد من الستايروفوم يحتوي على طبقة من الثلج الجاف لتجميد الطبقة الأولية من مركب درجة حرارة القطع المثالي. انتظر بضع دقائق حتى يتصلب المركب ثم انقل القالب إلى سطح الطاولة. أضف مركب إضافي بدرجة حرارة القطع المثلى حتى يمتلئ القالب.

اترك الطبقة الأولى تذوب تماما قبل إعادة القالب إلى الثلج الجاف حتى يصبح التجميد الكامل. بعد تجميدها، خزن القوالب عند ناقص 80 درجة مئوية أو تابع عملية التقسيم بالتجميد للحصول على ستة مقاطع ميكرومتر. باستخدام ماصة، انقل خمسة ملليلتر من وسط نقص الأكسجين لكل صفيحة عضوية قلبية بشرية بحجم 96 بئر إلى قارورة زراعة الخلايا.

ضع القارورة داخل غرفة نقص الأكسجين وغسل الغرفة بغاز فاقد الأكسجين مكون من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و95٪ نيتروجين لمدة ثلاث دقائق. ضع الحجرة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة على الأقل قبل بدء نقص الأكسجين. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أزل حوالي 150 ميكرولتر من الوسائط من جميع آبار صفيحة القلب العضوي البشري.

ثم، باستخدام ماصة بسعة 200 ميكرولتر، قم بإزالة الوسط المتبقي من كل بئر بحذر دون الإزعاج بالأورجينويدات. أضف 50 ميكرولتر من وسط نقص الأكسجين إلى كل بئر. ضع صفيحة القلب العضوية البشرية في غرفة نقص الأكسجين.

وغسل الحجرة بغاز لاتوكسي مكون من 5٪ ثاني أكسيد الكربون و95٪ نيتروجين لمدة ثلاث دقائق. ضع غرفة نقص الأكسجين في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة ست ساعات. لبدء إعادة الأكسجين، قم بإزالة الأعضاء القلبية البشرية من غرفة نقص الأكسجين.

باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 150 ميكرولتر من وسائط RB+ الساخنة مسبقا إلى كل بئر. وأخيرا، ضع الصفيحة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية واترك ما لا يقل عن ثلاث ساعات من إعادة الأكسجين قبل إجراء الفحوصات في المراحل التالية. بعد ست ساعات من نقص الأكسجين و24 ساعة من إعادة التروية، زاد نشاط إنزيم اللاكتات خارج الخلايا بشكل ملحوظ في الأعضاء القلبية البشرية المصابة مقارنة بالأشخاص غير المصابين.

أظهرت العضويات القلبية المعالجة بنقص الأكسجين نوى خلايا عضلة القلب الموجبة ل TUNEL، وكانت نسبة نوى خلايا عضلة القلب الموجبة ل TUNEL أعلى بشكل ملحوظ في الأعضاء المصابة مقارنة بالمجموعة غير المصابة. لوحظ زيادة زمنية في تكوين الندبة مع زيادة مدة نقص الأكسجين قبل إعادة الأكسجين. بعد 24 ساعة من إعادة التروية، كان 69٪ من الأعضاء القلبية البشرية غير المصابة ينبضون، بينما لم يكن أي من الأعضاء المصابة يضرب.

أظهرت العضويات القلبية البشرية غير المصابة انتقالات كالسيوم متزامنة عبر خمس مناطق ذات اهتمام، مع ظهور القمم في نفس الوقت وبموجات متشابهة. لم تظهر الأعضاء القلبية البشرية المصابة انقباضات منسقة، بل أظهرت انتقالات غير منتظمة تلقائية للكالسيوم عبر مناطق الاهتمام. يتيح هذا البروتوكول للباحثين تقليد احتجان عضلة القلب في الأعضاء القلبية البشرية المشتقة من iPSC.

أكبر تحد تقني لضمان حدوث إصابة قابلة لتكرار هو إزالة الوسائط الموجودة بالكامل. تهدف دراساتنا المستقبلية إلى تحديد العوامل التي يمكن أن تعزز تجدد الأنسجة في نماذج الأعضاء القلبية البشرية.