أخذ عينات الحمض النووي البيئي من أوعية مراقبة الحيتان لمراقبة الحيتانيات

يوفر هذا البروتوكول نهجا موحدا لأخذ عينات eDNA من الحيتان أثناء رحلات مراقبة الحيتان. تتوفر العديد من طرق أخذ عينات الحمض النووي eDNA المختلفة. وهذا يعيق تحليل البيانات المقارنة.

تم تحسين بروتوكولنا عبر الظروف البيئية وإجراءات الحماية من التلوث. وبدعم من مختبر راديو eDNA، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول من قبل غير الخبراء والعلماء المواطنين خلال أنشطة مراقبة الحيتان وفي جميع أنحاء العالم. للبدء، قم بإعداد مواد توثيق ميداني، بما في ذلك أوراق البيانات الميدانية والبروتوكول الميداني المصفح خطوة بخطوة لأخذ عينات الحمض النووي البيئي للحيتانيات.

ضع علامة مقاومة للماء، ومرشحين eDNA لكل بصمة فلوك، وعدد كاف من القفازات، وحاوية نفايات مخصصة في الصندوق. جهز دلو أو أكثر صلبة مناسبة لنوع السفينة وتكوينها على متن السفينة، وحاوية DNA بيئية ثانوية، ومضخة مياه متنقلة أو تفريغ مائي متنقلة. ارتد القفازات أثناء جميع التعامل مع المعدات وغير القفازات بين المهام.

لتعقيم المعدات، ضع محلول مبيض منزلي مخفف عن طريق رش جميع أسطح الدلاء والأغطية والحاويات وأنابيب المضخات بشكل متساو. اشطف جيدا بماء الصنبور ثلاث مرات. أحضر جميع المواد إلى الطائرة قبل وصول الركاب وخزنها في مكان نظيف مخصص.

تنسيق أخذ العينات، التوقيت، وموقع السفينة مع طاقم السفينة. راقب أنماط الظهور على الماء لتوقع غوص الحيتان. اجمع 20 لترا من مياه البحر من العلامة البحرية في أقرب وقت ممكن، مع ضمان ألا يكون هناك تأخير يزيد عن 10 دقائق بعد الغوص من الحوت.

احصل على عينات من مناطق مختلفة باستخدام ظروف لوجستية مخصصة تناسب كل موقع ونوع سفينة. إذا لزم الأمر، انقل المياه المجمعة إلى محطة ترشيح مخصصة على متن السفينة، لتجنب الانسكاب. سجل هوية الأنواع، إحداثيات نظام التموضع الجغرافي، الوقت، وتكرار التعريف بالعينة في ورقة البيانات.

غير القفازات قبل الترشيح. افتح كيس الفلتر وتعامل مع الفلتر فقط عند المقبس. أدخل المدخل في أنبوب التنفس، ثم وصل أنبوب المضخة إلى المخرج.

اغمر أنبوب التنفس في عينة الماء دون غمر غلاف الفلتر، واضبط المضخة على معدل تدفق سريع وثابت. قم بتصفية 10 لترات بشكل مستمر مع مراقبة استقرار التدفق. بعد ذلك، قلب الفلتر وشغل المضخة لمدة 30 إلى 60 ثانية لإزالة الماء المتبقي.

خصص إعداد مضخة الترشيح حسب ظروف الحقل. قم بإيقاف المضخة وافصل الأنبوب. ضع الفلتر في كيسه الأصلي وضع عليه علامة فورا.

غير القفازات واستعد لإجراء الترشيح للنسخة الثانية. احتفظ بفلاتر الحمض النووي البيئية المحافظة ذاتيا في وعاء آمن وجاف في غرفة مظللة بدرجة حرارة محيطة. قم بحفظ الفلاتر في الثلاجة إذا تجاوزت درجة الحرارة المحيطة 20 درجة مئوية واشحنها خلال ثلاثة أشهر.

قم بإجراء جميع الإجراءات المخبرية في غرف مخصصة ومعقمة بالأشعة فوق البنفسجية مع تهوية مناسبة. بعد ارتداء قفازات خالية من الحمض النووي وملابس واقية، نظف طاولات العمل جيدا. باستخدام ملقط خالية من الحمض النووي، قم بطي غشاء المرشح إلى مثلثات وانقله إلى أنبوب تفاعل بحجم ملليتر مع توجيه الطرف للأسفل.

أضف 400 ميكرولتر مخزن تحلل يتكون من 380 ميكرولتر من مخزن TES و20 ميكرولتر من بروتيناز K إلى كل أنبوب تفاعل. الدوامة لفترة وجيزة وتحتضن عند 56 درجة مئوية لمدة لا تقل عن ثلاث ساعات مع الاضطراب. ضع الفلتر في مدخل بلاستيكي ذو قاع مثقب وجهاز طرد مركزي بحرارة 18، 626 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لفصل مخزن التحلل عن الفلتر.

مواد استخراج البيبت في ألواح الغسيل وألواح الشفاف. استخدم عدة ألواح ربط إذا تجاوز حجم الليزات الكلي 300 ميكرولتر. جسيمات مغناطيسية في الدوامة، وإضافة 30 ميكرولتر لكل بئر في صفيحة الربط الأولى.

شغل برنامج امتصاص الحمض النووي الأولي للوحي ربط وبرنامج استخراج الحمض النووي اللاحق على الروبوت. لتشغيل جميع تفاعلات QPCR بثلاث نسخ، جهز المزيج الرئيسي المطلوب في مساحة عمل مخصصة ووزعه عبر الآبار. أضف ثلاثة ميكرولترات من معيار الحمض النووي المستهدف أو مستخلص eDNA إلى كل بئر.

بعد إغلاق لوحة PCR المحضرة، قم بإضعها على حرارة 3,500G لمدة 10 ثوان، ثم وضعها في جهاز PCR الكمية في الوقت الحقيقي. وأخيرا، قم بإجراء الاختبار في ظروف ركوب الدراجات المثلى. تم جمع 247 عينة من الحمض النووي البيئي أو eDNA في خليج سكالفاندي في آيسلندا وفي جزر الأزور، وتشمل جمع ما يصل إلى 10 لترات من مياه البحر باستخدام مرشحين للحمض النووي الإلكتروني المحفوظين ذاتيا لكل بصمة فلوك.

من بين 44 مرشحا للحمض النووي الإلكتروني الذي تم تحليله للحمض النووي الإلكتروني للحوت الأحدب، أظهر 20 إشارة تضخيم، بينما أظهر 24 عدم تضخيم. أظهرت الفراغات الخارجية، وضوابط الميدان، وضوابط PCR الكمية عدم وجود تضخيم قابل للكشف، مما يشير إلى غياب التلوث. من بين التفاعلات الإيجابية، أظهرت تسعة مرشحات eDNA قيمة عتبة دورة واحدة على الأقل تحت حد الكشف، وتم تصنيفها كاكتشافات موثوقة.

أما المرشحات ال11 المتبقية من EDNA فقد أنتجت قيم عتبة دورة فوق حد الاكتشاف، مما يشير إلى اكتشافات معقولة. كانت قيمة عتبة الدورة المتوسطة أقل قليلا في مرشحات eDNA في جزر الأزور، حيث بلغت حوالي 34.7، مقارنة بمرشحات آيسلندا التي بلغت حوالي 36.9. لم يكن الفرق في قيم عتبة الدورة بين فلاتر eDNA في جزر الأزور وآيسلندا ذا دلالة إحصائية.

يمكن استخدام هذا البروتوكول في حملات أخذ عينات eDNA واسعة النطاق مستقبلا للتحقيق في التنوع البيولوجي البحري أو جينات أعداد الحيتان. يتيح هذا البروتوكول الكشف غير الجراحي ومراقبة الحيتانيات والأنواع المتزامنة عبر eDNA الموجود في بصمات الفلوك التي جمعت من أوعية مراقبة الحيتان.