توليد نموذج الفأر لتنشيط المناعة الأمومة في أوائل الحمل لتقييم الالتهاب قبل الولادة على النمو العصبي

يدرس مختبرنا كيف يغير الالتهاب السابق للولادة بيولوجيا الخلايا الدبقية الدقيقة، وهي خلايا المناعة في الدماغ التي تساهم في نتائج سلبية في النمو العصبي. تركز نماذج MI الحالية على منتصف الحمل. ومع ذلك، نقدم بروتوكول حمل مبكر يشمل أيضا مقاييس مراقبة الجودة لتحسين البقاء والاتساق.

يمكن تطبيق النموذج على أي نموذج فأر بري أو جيني لاستكشاف تأثير الالتهاب البيئي على تطور الدماغ. للبدء، قم بإعداد فأرتين أنثى C57 BL6 تتراوح أعمارهما بين ثمانية إلى عشرة أسابيع مع ذكور C57 BL6 في وقت متأخر من بعد الظهر أو المساء. في صباح اليوم التالي، قم بتقييم الإناث للفئران بحثا عن سدادات مهبلية واستمر في الفحص مرة واحدة يوميا حتى يحدث السداد.

السدادات مؤقتة وقد تسقط بحلول فترة بعد الظهر إذا لم يتم فحصها في الصباح. بعد تأكيد وجود سدادة مهبلية، قم بوزن الفأرة الأنثى وسجلي الوزن لمراقبة حالة الحمل من خلال تتبع زيادة الوزن عبر فترة الحمل. افصل الإناث الموصولات في أقفاص فردية وحافظ عليها تحت ظروف سكنية قياسية مع وصول مفرط للطعام والماء.

حدد الإناث المسدودات كيوم جنيني 0.5 وسجل تاريخ السدادة المهبلية لضمان تتبع دقيق لعمر الحمل. لإعادة تشكيل الدوائر البولي المتنقلة إلى محلول عالي التركيز، قم بإذائته في محلول ملحي أو معقم معقم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. فورتكس، محلول المخزن عالي التركيز.

ثم أخفف المحلول في محلول ملحي لتحضير مخزون منخفض التركيز. لتجنب تكرار دورات الذوبان، قم بتقسيم حوالي 125 ميكرولتر من المخزون منخفض التركيز في أنابيب بسعة 1.5 ملليتر، وتخزين الأنابيب عند 20 درجة مئوية أو 80 درجة مئوية. قبل الحقن مباشرة في اليوم 9.5 من الجنين.

قم بتخفيف مخزون الدوائر المتكاملة البولي منخفضة التركيز باستخدام محلول ملحي معقم للحصول على تركيز عملي. سخن المخزن العامل على درجة حرارة 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لضمان إعادة التشكيل الصحيح لتركيب حمض الريبونوكليك مزدوج الخيط. ثم تستخدم المحلول بدوامة أو ماصة لضمان تجانس الخليط قبل الحقن.

لتأكيد الحمل، قم بوزن السد في صباح يوم الحمل الجنيني 9.5. احسب حجم حقن متعدد الدوائر الدوائر لتنشيط المناعة الأمومة، أو MIA، وحجم حقن محلول ملحي 0.9٪ للضابطين. اسحب الحجم المناسب من محلول العمل أو محلول الملح المحضر إلى حقنة معقمة بقياس 27 أو أصغر.

الآن، قيد السد بشكل صحيح لتقليل الألم والضيق. حقن حمض البولي-IC أو محلول ملحي داخل الصفاق في الجزء السفلي الأيسر أو الأيمن فوق مستوى الورك مباشرة أو عند المجموعة الثانية من الحلمات. ثم تخلص من الحقن في حاوية BioSafety Sharps.

أيضا، سجل جانب الحقن للحفاظ على الاتساق عبر المجموعة. أعد السد فورا إلى قفص المنزل وراقب أي علامات ضيق. ثم أضف القفص الهيدروجيل لمدة لا تقل عن 24 ساعة بعد الحقن لمنع الجفاف المرتبط بسلوك المرض.

بعد ذلك، سجلي حجم جرعة الحقن من البولي-IC، وتاريخ ووقت الحقن، وعمر الحمل، ورقم دفعة الدوائر المتعددة الدواء. بعد ثلاث ساعات من الحقن، راقب كل فأر على حدة لمدة دقيقة واحدة وقيم سلوكا مثل انخفاض النشاط، أو انحناء الوضعية، أو تجهم الوجه، أو البراز المائي باستخدام مقياس ثلاثي النقاط. صنف الفئران التي تظهر واحدا أو أكثر من هذه السلوكيات على أنها تظهر سلوكيات مرضية حادة.

ثم، باستخدام طريقة طفيفة التوغل مثل نزيف الذيل، اجمع دم الأم بعناية من الأم المحقونة. اجمع حوالي 50 ميكرولتر من الدم. بعد تأكيد الإصابة بالدم، أعد السد إلى قفص المنزل.

اترك الدم المجمع يجلط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بعمل طرد مركزي للعينة على حرارة 2000 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة لفصل المصل عن الجلطة. بعد إعادة الطرد المركزي للعينة مرة أخرى، اجمع بعناية طبقة المصل العلوية الشفافة دون إزعاج الجلطة.

خزن المصل عند 20 درجة مئوية حتى يكون جاهزا لتحليل السيتوكين في المراحل النهائية. بعد الحقن، قم بوزن السدود يوميا لمدة ثلاثة أيام لمراقبة الاستجابة لحمض البولي IC. في يوم الولادة المتوقعة، سجل نتائج الولادة بما في ذلك حجم القمامة، وقابلية الجراء، أو عدم وجود جراء، للدلالة على فشل الحمل.

قم بإزالة أي جراء متوفى بسرعة والتخلص منها وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية. استخدم اختبارات ELISA أو اختبارات متعددة القنوات لقياس السيتوكينات الالتهابية مثل IL-6 وTNF-alpha في مصل الأم بعد فقدان المرض أو حقن التحكم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد القياس، استخدم النتائج لتحديد عتبة تمثيلية لاستجابة MIA.

وأخيرا، قم بإجراء تحليل إحصائي باستخدام برنامجنا لتقييم العلاقة بين مستوى IL-6 في المصل الأم ومستوى ألفا TNF. بعد إعطاء الدوائر متعددة الدوائر في اليوم المبكر 9.5، أظهرت سدود MIA ارتفاعا ملحوظا في مستويات IL-6 مقارنة بسدود التحكم. أظهرت مستويات ألفا من TNF علاقة إيجابية قوية مع مستويات IL-6 لدى الأم.

بين اليوم الجنيني 0.5 واليوم 9.5 من الجنين، زادت الأمهات التي نجحت في إنجاب الولادة وزنا أكبر بكثير من الأمر التي لم تنجب ولادة. بعد يوم واحد من الحقن، فقدت سدود MIA الوزن، بينما زادت سدود السيطرة المعالجة بالمحلول الملحي وزنها. لكن بحلول اليوم الثاني عشر من الجنين، أظهرت كلتا المجموعتين زيادة وزن متشابهة.

لم يؤثر وزن ما قبل الحمل على فعالية الحمل في العائلات المعالجة بالمحلول الملحي أو في سدود المفقود. ومع ذلك، فإن فئران C57 BL6 المأخوذة من مختبرات جاكسون حققت نجاحا أكبر من فئران C57 BL6 التي تم الحصول عليها من تشارلز ريفر خلال إجراء الجراحة. على النقيض من ذلك، لم يؤثر مصدر الدوائر البولي IC على فعالية الفضلات.

علاوة على ذلك، كانت الحيوانات المأخوذة من مختبرات جاكسون تستجيب التهابية أمومية أقوى كما تم قياسها بواسطة مصل IL-6 مقارنة بالحيوانات المستخرجة من تشارلز ريفر. في المقابل، كانت الاستجابة الالتهابية لدى الأم متشابهة بين مصادر مختلفة من التهاب الخلايا المتعددة المختلطة. يسمح البروتوكول بتوليد نموذج MIA المبكر القابل للتكرار وربط شدة التهاب الأم بنتائج التجارب النسلية. من الضروري الحفاظ على سجلات مفصلة، وتتبع أعداد دفعات المواد الكيميائية، وتقييم استجابات السيتوكين الأمومة في جميع السدود لضمان نتائج قابلة للتكرار.