رسم خريطة شكل الخلايا النجمية الكبدية في نماذج الفئران لتليف الكبد

يقدم هذا البروتوكول خط تصوير شامل لتصوير ونمذجة شكل الخلايا النجمية الكبدية في نسيج الكبد السليم. التصوير ثنائي الأبعاد الحالي يفتقد الشكل الكامل للخلايا النجمية، مما يحد من الرؤى الهيكلية والوظيفية. يتيح هذا البروتوكول التقاط متين لمعمارية ثلاثية الأبعاد معقدة.

للبدء، اضغط على راحتي يد الفأر المخدر لضمان التخدير المناسب. رش البطن بنسبة 70٪ إيثانول لترطيب الفرو. باستخدام ملقط، التقط الجلد في منتصف البطن المحاذي مع الأرجل الخلفية وابدأ بقطع الجلد لكشف البطن.

ثم استخدم أعواد قطنية مبللة ب PBS لتحريك الأمعاء والأعضاء الأخرى إلى الجانب ورفع الفص الأيسر. اقطع بعناية الغشاء المتصل بين الفص الأيسر والفص الذيلي. ثم استخدم خياطة لربط الفص الأيسر عند القاعدة العلوية.

اقطع الفص الأيسر أسفل عقدة الغرز وضعه جانبا لجمع عينات الأنسجة ومعالجتها. استخدم مسحات القطن المبللة ب PBS لتحريك الكبد وكشف الوريد البواب. ثم أدخل إبرة القسطرة بحذر في الوريد البابي عند منتصف طولها تقريبا.

أزل إبرة القسطرة. تأكد من تدفق الدم عبر القسطرة للدلالة على نجاح الإدخال. قم بتوصيل الأنبوب المملوء من مضخة التروية الجارية إلى القسطرة وحقن الكبد ب 20 ملليلتر من PBS.

قم بتثبيت الشريان الرئوي فوق الكبد باستخدام مصب دموي لمنع مرور PBS عبر القلب. اقطع الوريد الأجوف السفلي لتحرير تراكم الضغط. اضبط سرعة المضخة إلى خمسة مليليتر في الدقيقة.

بعد 15 دقيقة، أوقف المضخة لتحويل الخزان إلى 4٪ بارافورمالديهايد، ثم قم بترويض الكبد ب 25 ملليلتر من 4٪ بارافورمالديهايد. بمجرد اكتمال التروية، قم بإزالة الكبد من الأعضاء المحيطة عن طريق قطع الأنسجة المتصلة. ضع الكبد في أنبوب مخروطي بسعة 50 ملليلتر مملوء ب 25 ملليتر من 4٪ بارافورمالديهايد.

ضع الأنبوب أفقيا على منصة تأرجح على المقعد طوال الليل في غرفة باردة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية بسرعة 1.5 دورة في الدقيقة. في اليوم التالي، اغسل الكبد ثلاث مرات بنظام PBS على منصة هزاز لمدة 30 دقيقة لكل منها في درجة حرارة الغرفة بسرعة 1.5 دورة في الدقيقة. انقل الكبد إلى 20 ملليلتر من PBS مع 0.02٪ أزيد الصوديوم وخزنها عند أربع درجات مئوية.

اقطع عينات الكبد إلى قطع بحجم حوالي 0.5 إلى 1 سنتيمتر مكعب. انقل عينات الكبد إلى قوارير زجاجية ذات أغطية براغي. جفف العينات في سلسلة ميثانول مخففة بالماء من 20٪ إلى 80٪ على مدور عجلة بثماني دورات في الدقيقة لمدة ساعة لكل منها في درجة حرارة الغرفة.

بعد إجراء تبييض العينة، والنفاذ، والوسم المناعي، والتنظيف، حضن العينة في إيثر ديبنزيل طوال الليل في درجة حرارة الغرفة قبل التصوير. يمكن تخزين العينات في إيثر الديبنزيل لمدة تصل إلى عام واحد دون فقدان إشارة التلوين. للتصوير الدائري، ضع العينة المأخوذة في طبق زجاجي قاع بحجم 35 ملم مع قاع زجاجي رقم 1.5.

املأ الطبق بالسينامات الإيثيلي لغمر العينة بالكامل. ثم ضع الطبق على منصة المجهر الكونفوكي. احصل على صورة بلاطة على أكثر مستوى سطوع لالتقاط مساحة كبيرة من العينة باستخدام صيغة 1024 في 1024 وسرعة 600.

استنادا إلى صورة البلاط، اختر المناطق ذات الاهتمام لجمع مسح Z عالي الدقة. بعد ذلك، احصل على مكدس Z يمتد على عمق كامل الأنسجة المزيلة بأعلى دقة مدعومة بالمجهر باستخدام صيغة 1024 في 1024 وسرعة مسح 600. أدى التروية الناجحة وتثبيت كبد الفأر إلى لون أصفر بيج فاتح موحد.

أدى التروية غير السليمة إلى ظهور مناطق حمراء داكنة أو بنية من جلطات الدم، مما قلل من وضوح البصر وأدى إلى إشارة خلفية عالية في هذه المناطق. تم تحقيق شفافية بصرية كاملة بعد الحضانة في إيثر الديبنزيل حيث بدا النسيج صافيا مقارنة بما كان عليه قبل التنظيف. كشفت مكدسات Z عالية الدقة عن عمليات شجرية دقيقة تمتد من جسم خلايا الخلايا النجمية الكبدية الفردية.

أظهرت عينات كبد رباعي كلوريد الكربون الضابط والمزمنة إشارات فلورية قوية ومستقرة تحت المجهر الكونفوكلي. يقوم هذا الخط بإعادة إنتاج شكل الخلايا النجمية في الخادم المعقد للبيئة الدقيقة، ملتقطا العمليات التغصنية والعلاقات المكانية مع الخلايا المجاورة. الالتزام بالوقت هو اعتبار مهم عند تنفيذ البروتوكول.

تستغرق عملية التسوية حوالي ثلاثة أسابيع، مما يتطلب تخطيطا مسبقا. من خلال تمكين التحليل المورفومتري ثلاثي الأبعاد الدقيق، تربط هذه المنصة بنية الأرومات الليفية بالوظائف، مما يعزز رؤى حول توازن الأنسجة وآلية Z.