عزل وتنقية جزر البنكرياس من فئران لويس باستخدام الهضم الإنزيمي وفصل الكثافة والتدرج

تركز أبحاثنا على تطوير بروتوكول عزل عين لويس رات عالي الإنتاجية موحد لتحسين الإنتاجية، والنقائية، والقابلية، وطول العمر الوظيفي. تنتج الطرق الحالية عيون غير نقية متغيرة وقصيرة العمر. يقوم هذا البروتوكول بتوحيد الهضم والتنقية والتجميع لتحسين الاتساق وطول العمر.

للبدء، ضع فأر مقتل تحت المجهر. باستخدام مقص الجلد، قم بعمل شق على شكل حرف V يبدأ من تخليق العانة باتجاه كل قفص صدري جانبي للوصول إلى تجويف البطن. باستخدام ملقط مسطح، اسحب الأمعاء الدقيقة والغليظة إلى الجانب الأيسر من الحيوان لإزالة مساحة تجويف البطن.

ثم استخدم الملقط المسطح ومنظمات الدم المنحنية لفتح الجزء العلوي من الاثني عشر. تأكد من أن القناة الصفراء المشتركة والوريد البابي للكبد في مجال الرؤية. الآن استخدم الهيموستاتات المنحنية لسحب الكبد في اتجاه الرأس.

قم بتثبيت القناة الصفراوية المشتركة والوريد الكبدي على بعد مليمتر إلى مليمتر من الكبد. تحت المجهر، باستخدام الملقط المسطح والمستمعين المسطحين، حرك بلطف محتويات الاثني عشر لإزالة المصرة من الأودي. ثم قم بتثبيت الاثني عشر بلطف على بعد حوالي خمسة مليمترات من كل جانب من مصرة الأودي لعزل المنطقة المحيطة.

تأكد من تقليل الضغط للحفاظ على سلامة الأنسجة. أدخل إبرة الحقنة التي تحتوي على WDM المعقم بحذر عبر جدار الاثني عشر. مرر الإبرة عبر جسم المصرة ودفعها إلى القناة الرئيسية للبنكرياس لإجراء التروية.

مع الحفاظ على ضغط ثابت، قم بحقن 7 إلى 10 مليلترات من WDM في البنكرياس بمعدل حوالي 500 ميكرولتر في الثانية حتى ينتفخ البنكرياس بالكامل. الآن، أزل كلا الموستاتات المسطحة من الاثني عشر. ثم قم بتشريح البنكرياس بلطف وتحريره من الهياكل المحيطة بدءا من الطحال، المعدة، الأمعاء الغليظة، الاثني عشر، والميزنتار.

ارفع البنكرياس المثقوب بلطف باستخدام ملقط مسطح واستخدم مقصا دقيقا لقطع أي وصلات نسيج ضامة متبقية. انقل البنكرياس المستخرج فورا إلى طبق بتري يحتوي على محلول شطف مثلج بارد وبدأ في حصاد البنكرياس التالي أثناء تنظيف البنكرياس المستبعد. لتنظيف البنكرياس استخدم زوجا من الملقط المنحني الدقيق والمقص الشقيح الدقيق لإزالة الغدد اللمفاوية، والأنسجة الدهنية، والميزنتار، والأوعية الدموية الكبيرة من البنكرياس المثقوب إذا وجدت.

انقل البنكرياس المنظف إلى كأس معقم بسعة 600 ملليلتر يحتوي على 25 ملليتر من WDM البارد. غط الكأس بورق ألمنيوم معقم للحفاظ على النظافة أثناء النقل من مكان الجراحة إلى مساحة زراعة الخلايا. انقل الكأس إلى حمام ماء هزاز مداري مضبوط على 130 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.

عند علامة الدقيقة الخمسة، قم بتدوير الكأس يدويا باتجاه عقارب الساعة ثم عكسها للمساعدة في تفكك الأنسجة. عند الدقيقة العاشرة، انقل الكأس بسرعة وغمره في الثلج لإبطاء نشاط الإنزيمات. ثم أضف كمية متساوية من محلول التبريد إلى المحلول في الكأس لإيقاف الهضم.

باستخدام حقنة بسعة 50 ملليلتر مزودة بإبرة شوكية عيار 14، استنشق وطرد تعليق الأنسجة بلطف بشكل متكرر لفصل شظايا الأنسجة الكبيرة. انقل نظام التعليق إلى أنابيب مخروطية بسعة 200 ملليلتر. بعد طرد التعليق، قم بتفريغ المادة الفائقة بعناية وأعد تعليق الحبيبة في 100 ملليلتر من وسط الغسيل.

الآن قم بتصفية التعليق عبر منخل معقم بحجم 500 ميكرومتر موضوع فوق كأس معقم بسعة 600 ملليلتر لإزالة الأنسجة الكبيرة غير المهضومة. انقل الفلترة إلى أنابيب مخروطية جديدة بسعة 200 ملليلتر قبل إعادة الطرد المركزي. لتنقية العين، استخدم ماصة مصلية مسبقة بسعة 10 ملليلتر لإعادة تعليق كل حبيبة نسيج في محلول تدرج بحجم 15 ملليلتر لكل ملليلتر من حجم الحبيبات.

اخلط بلطف حتى يصبح التعليق موحدا. قم بتوزيع 15 ملليلتر من تعليق الخلية بعناية في أسفل كل أنبوب مخروطي بحجم 50 ملليلتر مع تجنب ملامسة جدران الأنبوب لضمان تدرج نظيف. ثم استخدم مضخة الحقنة لتوزيع 10 ملليلتر من كل تدرج بمعدل خمسة ملليلتر في الدقيقة مع وضع طرف الإبرة 16 مقياس مقابل الجدار الداخلي للأنبوب لمنع الخلط.

بعد الطرد المركزي للأنابيب، حدد طبقة العين الموجودة عند الواجهات بين طبقات التدرج. باستخدام ماصحة المضي المتزوجة، اجمع طبقة العين، وانقل العينات المجمعة إلى أنبوب مخروطي مبرد مسبقا بسعة 200 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليتر من وسط الغسيل. ارفع الحجم إلى 200 ملليلتر باستخدام وسط الغسيل وقم بخطوات الغسل والطرد المركزي التالية.

ثم قم بتغليف الحلقات بشكل متساو في أطباق بتري 100 ملم غير معالجة بمزرعة الأنسجة باستخدام طبق واحد لكل خمسة بنكرياس معالجة. عبر العزل الاختباري، كان العائد 3,330 مكافئ للعين لكل بنكرياس مع متوسط قطر عين في صندوق 50 إلى 100 ميكرومتر. أسفر التكبير الآلي عن 98,832 جسما إجمالا، وهو ما ارتبط ارتباطا قويا بمكافئات الجفن اليدوية التي تم قياسها في اليوم الصفر.

كانت نقاء الغدد الصماء حوالي 98.56٪ بناء على صبغة الديثوزون في اليوم الأول. كانت مؤشرات التحفيز 9.37 في اليوم الأول، 8.34 في اليوم الثالث، و6.7 في اليوم السابع دون فروق ذات دلالة إحصائية بين النقاط الزمنية. تمكن هذه الطريقة من دراسة زراعة العين، وظيفة خلايا بيتا، عكس مرض السكري، تغليف العين، والتفاعلات المناعية أو البيئة الدقيقة بين العين.

يمكن تطبيق هذا البروتوكول على عمليات الزرع قبل السريرية، ونمذجة السكري، ودراسات التغليف، والاختبارات الوظيفية المختبرية التي تتطلب عيون لويس رات عالية النقاة.