بروتوكول تفكك الخلايا الواحدة، وتسلسل الحمض النووي الريبي، وعزل الخلايا الظهارية العضلية والأرومات الليفية من الغدد الرملية واللعابية المتقدمة في السن

يدرس مختبري كيف تؤثر التغيرات المرتبطة بالعمر في اللعاب والغدد الدمعية على أنواع الخلايا المختلفة باستخدام قياس تدفق الخلايا وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. طرق التفكك القياسية تعيد بشكل سيء خلايا الظهارة الهشة من الغدد اللعابية والدمعية القديمة. وبروتوكلي يحسن بقاء الخلايا ويتيح تحليلا موثوقا لخلية واحدة وفرز الخلايا.

للبدء، ضع الفأر المرح على ظهر الطاولة على طاولة التشريح. باستخدام ملقط ومقص ناعم، اقطع الجلد بين العين والأذن. اسحب الجلد بلطف لكشف الغدة الدمعية.

باستخدام ملقط ذو طرف باهت، ارفع الغدة الدمعية قليلا. افصل الأنسجة الضامة المحيطة بحركة دائرية بلطف عن طريق إغرائها. حدد الحدود المرئية للغدة الدمعية وافصلها عن الأنسجة المجاورة، بما في ذلك الغدة النكفية.

ثم نقل الغدة الدمعية إلى طبق بتري بقطر 35 ملم يحتوي على اثنين ملليلتر من PBS البارد على الثلج. تحت المجهر التشريحي، أزل الدهون المتبقية، وأزل بعناية كبسولة النسيج الضام من الغدة الدمعية. ضع طبق بترى معقم بقطر 35 ملم على الثلج.

أضف 800 إلى 1000 ميكرولتر من PBS البارد إلى مركز الطبق وانقل غدة دمعة واحدة إلى PBS. تأكد من بقاء الأنسجة مغمورة في PBS. باستخدام مشرطين معقمين، قم بتقطيع الغدة الدموعية إلى شظايا صغيرة حتى تصل إلى قوام ناعم يشبه المعجون.

اجمع شظايا الأنسجة على جانب واحد من الطبق. استنشق بقايا PBS واغسل الشظايا بملليتر واحد من PBS البارد الطازج. انقل شظايا الأنسجة المغسولة إلى صفيحة مكونة من 12 بئر تحتوي على ملليلتر لكل بئر من وسط الهضم المسخن مسبقا.

ضع الطبق في حمام ماء مهز وحضانة على حرارة 37 درجة مئوية و60 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة. باستخدام رأس ماصة عريض سعة ملليلتر واحد، قم بتثبيط النسيج بلطف 15 مرة. أعد الطبق إلى حمام الماء المهتز واستمر في الحضانة لمدة 30 دقيقة إضافية.

بعد ذلك، باستخدام رأس ماصة عادية بسعة مليليتر واحد، قم بتثبيط العينة بلطف 10 مرات ثم حضن العينة مرة أخرى لمدة 30 دقيقة. ثم قم بتعويذة العينة بلطف 10 مرات وانقل تعليق الخلية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة دولفين بسعة ملليترين. أضف ملليتر واحد من وسط حاجز البرودة، أو BM1، إلى كل بئر من الطبق لجمع وسط الهضم المتبقي الذي يحتوي على خلايا متبقية، وضع الطبق على الثلج حتى الخطوة التالية.

قم بطرد المركزي على أنابيب التعليق الخلوي عند 300 جيلون لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة من كل أنبوب. انقل BM1 من كل بئر في الصفيحة التي تحتوي على خلايا متبقية إلى الأنبوب المقابل.

بعد ذلك، أضف 600 ميكرولتر من BM1 البارد إلى كل بئر لشطف الخلايا المتبقية ونقل الغسيل إلى الأنبوب المقابل ليدمج مع تعليق الخلية. أعد تعليق التعليق بلطف على الخلية. قم بطرد مركزي الأنابيب مرة أخرى عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من السوبرناتان.

أضف ملليتر واحد من أكوتاز إلى حبيبات الخلايا وأعد تعليق الخلايا بلطف. حضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية و60 دورة في الدقيقة لمدة خمس إلى عشر دقائق. باستخدام رأس ماصة بسعة ملليلتر واحد، قم بتقليص العينة بلطف 10 مرات.

ثم أضف ملليتر واحد من BM2 البارد إلى الأنبوب لإنهاء التفاعل الإنزيمي عن طريق تخفيف الأكيوتاز. قم بعمل الطرد المركزي في الأنبوب عند 300 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت. أضف وسط يحتوي على DNase 1 بتركيز 200 وحدة لكل ملليلتر إلى الأنبوب لإعادة تعليق الخلايا وملء الأنبوب حتى الأعلى.

حضن الأنبوب لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وأعد تعليقه بلطف مرة واحدة بعد خمس دقائق. وفي الوقت نفسه، ضع مصفاة خلية بحجم 70 ميكرومتر فوق أنبوب مخروطي بسعة 15 ملليتر، ورطب المصفاة مسبقا بملليتر واحد من BM3. بعد الحضانة، انقل تعليق الخلية إلى المصفاة.

أضف ملليتر واحد من BM3 إلى أنبوب الجمع الأصلي لشطفه ونقل الشطف إلى نفس المصفاة. اغسل المصفاة بخمسة ملليلتر إضافية من BM3. وأخيرا، حدد تركيز الخلية وصلاحية تعليق الخلية المفلتر باستخدام صبغة تريبان بلو وعداد خلوي آلي.

تابع التطبيقات التالية، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد تعبير الجينات، أو فرز الخلايا المعتمدة على تدفق الخلايا المعتمدة على قياس الخلايا الموسومة بالفلورية. حدد تحليل UMAP لبيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية تجمعات ظهارية وبثمية ممثلة جيدا في الغدة الدمعية، بما في ذلك الخلايا العضلية الظهارية والأرومات الليفية، بالإضافة إلى مجموعات متنوعة من الخلايا المناعية. احتوت الغدد الدمعية المتقدمة في السن على كمية وفيرة من البلازما وخلايا B المنشطة التي تعبر عن IGHM وIGHD.

مكن نظام القياس الخلوي التسلسلي من فصل الخلايا الظهارية الإيجابية ل EpCAM، وGFP، والخلايا الجدارية الإيجابية ل EpCAM، والخلايا الجدارية الإيجابية ل GFP. كانت الخلايا الليفية الموجبة ل GFP التي تعبر عن PDGFR ألفا سلبية EpCAM، مما يسمح بالتمييز بين الخلايا الطهارية. في فئران PDGFR ألفا وEGFP، عبرت جميع الخلايا الموجبة ل GFP أيضا عن الكولاجين واحد، مما يؤكد هوية الخلايا الليفية.

أظهر تحليل التدفق الخلوي أن 99.6٪ من الخلايا الموجبة ل GFP كانت تتوافق مع الخلايا المصبوغة ب PDGFR ألفا المناعي. تم تصميم هذا البروتوكول لعزل الخلايا المفردة الحية من الغدد الدمعية لتوصيف جزيئيات التجمعات الظهارية والسترومال والمناعة. التحدي الرئيسي هو تقليل الإجهاد الميكانيكي والإنزيمي أثناء فصل الأنسجة القديمة الهشة، مع الحفاظ أيضا على قدرة عالية على البقاء الخلوي لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية.

بعد هذا الإجراء، يمكن استخدام الخلايا المعزولة لتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية، وتسلسل الحمض النووي الريبي الضخم، والتحليل الجزيئي لمجموعات خلايا محددة. يمكن أيضا زراعة الخلايا المصنفة لإجراء اختبارات وظيفية لاحقة.