إعادة برمجة خطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من عينات معطف بافي المجمدة

الغرض من هذا البروتوكول هو إعادة برمجة معاطف البوفي المجمدة البشرية أو PBMCs إلى خلايا جذعية متعددة القدرات مستحثة. يقوم هذا البروتوكول بتنقية الفتاة السودية بشكل فريد بعد إذابة الغلاف ويحدد شكل الخلية الجسدي الذي يدل على نجاح إعادة البرمجة. للبدء، استرجع معطف البافي المجمد المستخرج من دم الإنسان وضعه على الثلج.

قم بتدوير العينة بلطف في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية وأخرج القارورة عندما يبقى فقط طبقة جليدية صغيرة. انقل محتويات القارورة بحذر إلى أنبوب مخروطي يحتوي على 12 ملليلتر من DPBS. اشطف القارورة بملليلتر واحد من DPBS، وأضف الشطف إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على الخلايا المستخرجة.

قم بطرد العينة باستخدام دوار دلو متحرك على حرارة 200 جرام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. قم بإزالة السوبرناتانت بعناية، وأعد تعليق حبيبة الخلية في أربعة ملليلتر من DPBS تحتوي على 1٪ FBS. بعد ذلك، ضع طبقة من خليط الطبقة القوية بلطف فوق ثلاثة ملليلتر من محلول تدرج الكثافة، مع تجنب الخلط عند الواجهة.

الطرد المركزي باستخدام دوار دلو متحرك بوزن 800 جرام لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع إيقاف الفرامل. باستخدام ماصة، قم بإزالة وتخلص من طبقة البلازما العليا دون إزعاج واجهة البلازما مع التدرج. ثم إزالة خلية الدم أحادية النواة الطرفية، أو طبقة PBMC عند الواجهة ونقلها إلى أنبوب نظيف بسعة 15 ملليتر.

اغسل أنابيب PBMC بإضافة ثلاثة ملليلتر من وسط التمدد وعمل الطرد المركزي عند 200 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المادة الفائقة بعناية وأعد تعليق الحبيبة في وسط تمدد بحجم اثنين مليلتر يحتوي على سيتوكينات مثل SCF وIL-3 وEPO وIGF-1. ضع الخلايا في بئر واحد من صفيحة ب 12 بئر.

زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و20٪ أكسجين لمدة 10 إلى 14 يوما. استبدل نصف الوسط كل يومين حتى يلاحظ وجود كثيف من الخلايا الحمراء اللامعة والدائرية، مما يشير إلى أن الخلايا جاهزة للنقل. بعد ثلاثة أيام من النقل بفيروس سينداي الحامل لعوامل ياماناكا، قم بتغليف الخلايا على الأرومات الليفية الجنينية للفئران بمقدار ملليلتر لكل بئر.

حضن المزارع لمدة حوالي سبعة أيام، مع تغذية المستعمرات الناشئة بوسائط hESC كل يومين. ضع الصفيحة التي تحتوي على الخلايا المحولة والمستعمرات الناتجة تحت مجهر تشريح. استخدم المجهر لتحديد مستعمرة واحدة لالتقاط ورفع غطاء الصفيحة لكشف البئر.

افتح الحقنة معقم واكشف الإبرة. بتوجيه المجهر، استخدم طرف الإبرة لفصل المستعمرة عن الخلايا المغذية المحيطة عن طريق تتبع حدود المستعمرة. استخدم رأس الإبرة لقطع المستعمرة إلى عدة قطع متساوية الحجم.

إذا لم تنفصل القطع، استخدم جانب الإبرة لسحب أو كشطها من اللوح حتى تصبح عائمة. الآن باستخدام ماصة P200، حدد موقع المستعمرة المختارة تحت المجهر، واسحب المستعمرة العائمة مع الماصة، وانقلها إلى بئر من الصفيحة المعدة 24 بئرا. تأكد من نقل المستعمرة بأكملها دون جمع مستعمرات أخرى أو خلايا تغذية.

ضع الصفيحة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و20٪ أكسجين حتى يتم الوصول إلى التقاء المطلوب في الحاضنة. حدد المستعمرات الكبيرة والمستديرة التي تظهر حوافها المتوهجة على أنها جاهزة للانقسام. استنشق الوسائط من البئر وشطف العينة مرة واحدة بملليتر واحد من DPBS.

ثم أزل DPBS وأضف 500 ميكرولتر من مخزن تفكك EDTA بحجم 0.5 ملليمول. حضن العينة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة دقيقتين حتى ترتخي المستعمرات وتتجمع الخلايا لترفيه. بعد ذلك، أزل اللوحة من الحاضنة واسحب مخزن تفكك EDTA.

باستخدام ماصة P1000، اجمع الخلايا باستخدام ملليلتر واحد من وسط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات عن طريق التوصيل بلطف للأعلى والأسفل حتى تنفصل المستعمرات وتفتت قليلا. انقل ملليتر واحد من الوسط والخلايا إلى صفيحة جديدة ذات ستة آبار تحتوي على ملليلتر واحد من وسط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات الطازجة. ضع الخلايا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و20٪ أكسجين.

أطعم الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة يوميا حتى يلتقي البئر ويصبح جاهزا للانفصال. وفي الوقت نفسه، غط طبقا بحجم 10 سنتيمترات بمحلول فيترونكتين بسعة 7 ملليتر من خمسة ميكروغرامات لكل ملليلتر محضر في DPBS وحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. للاستمرار في التقسيم، أضف 7 إلى 10 ملليلتر من وسط الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى طبق بحجم 10 سنتيمترات وانقل الخلايا من صفيحة الستة إلى الطبق بنسبة 1:1، ثم حضن كما أوضح سابقا.

تأكد من أن الخلايا في طبق العشرة سنتيمترات متلاقية قبل تقسيم الخلايا مرة أخرى. قم بضبط نسبة الانقسام بناء على شكل الخلية والكثافة، عادة باستخدام نسبة 1:10، وسجل رقم المقطع في كل مقطع. وأخيرا، توصيف الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة من خلال تأكيد تعبير علامة الجذع NANOG باستخدام التألق المناعي.

تمايز الخلايا إلى سلاسل الأديم الخارجي، والأديم المتوسط، والانتباذ الداخلي باستخدام ظروف زراعة محددة. تقييم إمكانات التمايز من خلال التلوين ل PAX6 وBrachyury وSOX17، مع فقدان تعبير NANOG. في نهاية التوسع، تمايزت الخلايا العضلية الخلفية إلى أحمر الدم تظهر كخلايا مستديرة لامعة كبيرة وصغيرة.

بينما كانت الزراعة التي تفتقر لهذه الخلايا أو التي تبدو ميتة من غير المرجح أن تعيد برمجتها بنجاح. تميزت عمليات النقل وإعادة البرمجة الناجحة بظهور مستعمرات خلايا جذعية متعددة القدرات مستحثة على الخلايا المغذية المشعة، والتي طورت بعد ذلك شكل الخلايا الجذعية النموذجي. بينما الخلايا التي لم تتبنى شكلا شبيها بالخلايا الجذعية لم تعاد برمجتها بنجاح.

أظهرت الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي أعيد برمجتها بنجاح مستعمرات كثيفة ومستديرة ذات حواف ناعمة ومضيئة. تم تنظيف النسخ الفرعية ذات الشكل الأقل مثالية، مثل التفاضل التلقائي أو المراكز الكثيفة، عن طريق تعديل ظروف الانقسام. بعض المستعمرات المختارة لم تتوسع بنجاح.

بالإضافة إلى الشكل، أظهرت الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة جذعية كما يتضح من تعبير علامة الجذع NANOG. أظهرت الخلايا الجذعية متعددة القدرات المعاد برمجتها إمكانية التمايز إلى الأديم الخارجي، والأديم المتوسط، والإنبوتيدرم. يوفر هذا البروتوكول نقاط تحقق مفصلة لتتبع وتوقع نجاح إعادة البرمجة.

للتأكد من أن خط iPSC مناسب للاستخدام، يجب إجراء التصنيف الكاريوبي، والتصنيف الجيني، والاختبارات المنتظمة للميكوبلازما. يسمح هذا البروتوكول بإعادة البرمجة من مجموعات المرضى الحالية باستخدام معاطف بافي بنوكية حيوية، مما يوسع فائدة تقنية iPSC.