استخدام الرنين المغناطيسي النووي بالمحلول لتوصيف المكثفات الجزيئية الحيوية تحت ظروف ثنائية المراحل

طورنا طرقا بالرنين المغناطيسي النووي لدراسة المكثفات الجزيئية الحيوية. هذه النقاط مهمة لتنظيم الخلية، لكن كل ما يعرفه هو الاضطراب المتعدد الذي يدل عليه. باستخدام طرقنا، نبحث في خصائص مادة المكثفات، ونحلل آلية تكوينها، ونراقب التغيرات طويلة الأمد مثل نضج المكثفات أو الرجفان المرضي للجزيئات الحيوية.

للبدء، جهز العينة النهائية ثنائية المراحل التي تم تثبيتها بواسطة هيدروجيل الأغاروز عن طريق خلط مخزونات البروتين، أو مخزونات الحمض النووي الريبي، أو كليهما مع مخزن الأغاروز الدافئ المعني في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر. عادة ما يكون تركيز البروتين النهائي، أو تركيز الحمض النووي الريبي، بين 50 إلى 500 ميكرومولار للكشف عن الرنين المغناطيسي النووي. أدخل العينة ثنائية الطور المحضرة في مطياف، ثم قم بقفل وتثبيت ومطابقة وضبط قناة البروتون كالمعتاد.

قم بمعايرة طول النبضة بمقدار 90 درجة على قناة البروتون باستخدام إجراء المعايرة العام. ثم سجل طيفا أحادي البعد مكبوت الماء وتحقق مما إذا كان الطيف يحتوي على إشارات جزيئية حيوية قوية. إذا لم تلاحظ إشارة أو لم تلاحظ إشارة قليلة، لا تتابع مع REDIFINE، بل استخدم CONDENSE-MT بدلا منه.

سجل تجربة مطيافية مرتبة بالانتشار لترتيب قوة تدرج الانتشار من 2 إلى 95٪ في 16 خطوة خطية. لمواصلة جمع البيانات لمجموعة REDIFINE الكاملة، أنشئ تسع تجارب PPP GPQ S19 جديدة من خلال نسخ المعلمات من التجربة الأولية التي تم تشغيلها للتو. في كل تجربة متتالية، تغير تأخير انتشار D20 فقط بخطوات متغيرة ليشمل النطاق من 100 إلى 1000 مللي ثانية.

نفذ كل من هذه التجارب مع الأمر المناسب. استخدم آخر N للحفاظ على كسب المستقبل طوال التجارب العشر. قم بتعيين Q Sign مع SSB2 كوظيفة للنافذة.

ثم استخرج الشريحة الخامسة باستخدام الأمر المناسب. الطيف أحادي البعد وحفظ معلمات المراحل إلى مجموعة البيانات ثنائية الأبعاد. معالجة مجموعة البيانات ثنائية الأبعاد باستخدام XF2 وإجراء تصحيح الأساس باستخدام ABS2.

بعد ذلك، استخرج الشرائح ال16 مع تقسيم ثنائي الأبعاد. كرر نفس الإجراء في التجارب التسع المتبقية. تحقق على الأقل من أول أربع إلى خمس شرائح لضمان المراحل الصحيحة وتصحيح الخط الأساسي.

إذا لزم الأمر، صحح المراحل والأساس يدويا. ثم استخدم كود MATLAB المناسب للتحليل. في الشيفرة، تعديل أوقات الانتشار، وضبط قيم PG حسب شدة تدرج المجس، وتعيين التجارب من واحد إلى عشرة بناء على إجمالي عدد التجارب.

ثم قم بملاءمة البيانات وفقا لنموذج REDIFINE باستخدام هذا الكود. سجل طيف كبت الماء أحادي البعد. إذا تم ملاحظة إشارة قليلة جدا، تابع تجربة CONDENSE-MT.

تحديد معدل R1 للماء بواسطة استرداد الانعكاس من T1 لتقنية CONDENSE-MT الكمية. انسخ تسلسل النبضات المقدم وقائمة الأمراض الجنسية إلى المجلدات المعنية. بعد معايرة نبضة البروتون بزاوية 90 درجة، اضبط NS على 2، DS على 0، D1 على 20 ثانية، SW على 10 أجزاء في المليون.

من TD2 إلى 16K ومن TD1 إلى 24. لتجربة CONDENSE-MT، انسخ مجموعة معلمات بروكر المقدمة، والتسلسل، وقائمة الترددات إلى مجلدات بروكر الخاصة. ثم قم بضبط الترددات والقدرة حسب مقياس الطيف.

اضبط P1 على طول النبضة المعايرة 90 درجة وP4 على ميكروثانية واحدة لدفع نبضة الإثارة لتجنب تخميد الإشعاع. اضبط NS على 2، DS على 16، D1 على أربع ثوان، SW2 إلى 20 جزء في المليون، TD2 إلى 8k، وTD1 على طول قائمة الترددات. اضبط SPNAM10 على Squa100,000، واضبط P10 على خمس ثوان.

ابحث عن قدرة SP10 التي تنتج إشعاعات 100 هرتز. اضبط قدرة SP10 لنبضة الإشعاع وفقا لذلك. شغل التجربة الزائفة ثنائية الأبعاد مع الأمر المناسب وقم بإعداد سلسلة من هذه التجارب الزائفة ثنائية الأبعاد، بقدرات إشعاع SP10 المتغيرة.

بعد تعديل جميع المعلمات، قم بتشغيل الكود لقراءة طيف الرنين المغناطيسي النووي (NMR)، الذي يدمج إشارة الماء وحفظها في متغير جديد. في استعادة عكس الكود، قم بضبط المسار إلى البيانات المناسبة وتحقق من منطقة تكامل المياه. ثم قم بضبط رقم التجربة الذي يحتوي على بيانات استعادة الانعكاس.

قم بتعيين جميع المعلمات التجريبية وأدخل قيم البركة الفارغة للأغاروز التي تم الحصول عليها سابقا عن طريق ملاءمة مجموعة بيانات الأغاروز بطريقة مشابهة. شغل القسم الأول من الرمز الفارغ المكثف للحصول على التوافق مع الاسترخاء الطولي للماء. ثم شغل قسم التوصيل الفارغ المكثف لبدء الشكل الحي الذي يوضح تقليل دالة التوافق.

شغل القسم التالي من الكود لتحديد الشكوك ورسم البيانات. حدد ملاءمة REDIFINE معاملات الانتشار في الطور المخفف والمكثف، وعدد البروتين في الطور المكثف، ومتوسط حجم القطرة، ونفاذية الطور بين الطور لعينة FUS في مجال N-طرفي. ظلت إشارة الرنين المغناطيسي النووي لمجال الطرف N في FUS قابلة للكشف في الطور المكثف.

لم يلاحظ أي فرق في ملف نقل المغنطة بين مرجع الأغاروز ونطاق FUS N-terminal بواسطة عينة مرحلية. بالنسبة لمكثفات RNA المتكررة في CAG، لا تلاحظ إشارة NMR. وبالتالي، يختلف ملف نقل المغنطة بشكل كبير عن مرجع الأغاروز.

قدمت تجربة CONDENSE-MT توصيفا ديناميكيا لمكثفات RNA المتكررة التوسعية. أظهر تحليل CONDENSE-MT حركيات تبادل البروتونات بين المكثف والماء السائب. كما أظهر تحليل CONDENSE-MT زمن الاسترخاء العرضي للحمض النووي الريبي في المكثف ومعدل الاسترخاء العرضي الظاهر للمياه السائبة.

في هذا البروتوكول، يمكننا توصيف خاصية المكثفات في حالة ثنائية الطور دون الحاجة إلى وسم كيميائي. تتعايش القطرات مع بيئة مخففة، مما يسمح بالتبادل بين الطورين ويحاكي البيئة الخلوية. يمكن أن تكمل طرقنا التي تركز على توصيف المكثفات بطرق الرنين المغناطيسي النووي التقليدية لدراسة تفاعلات البنية الجزيئية والديناميكيات عبر المراحل.

في الدراسات المستقبلية، نهدف إلى تطوير نماذج أكثر تعقيدا للمكثفات، وتكييف المنهجية مع أنظمة أكثر تعقيدا، وفي النهاية دراسة المكثفات مباشرة في بيئاتها داخل الخلية.