استخراج الحمض النووي من عمود متوسط الإنتاج باستخدام رفوف 24 بئرا

يركز بحثنا على مسارات مطبوعة ثلاثية الأبعاد لاستخلاص الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA باستخدام أعمدة الدوران المتوازية، مما يجسّر الفجوة بين الطرق اليدوية والآلية. يعالج هذا الابتكار محدودية طرق أعمدة الدوران اليدوية التي تتطلب عمالة كثيفة من خلال تمكين المعالجة المتزامنة لما يصل إلى 116 عينة من DNA أو RNA. للبدء، استخدم طابعة ثلاثية الأبعاد تعمل بتقنية ترسيب filament المنصهر مع فوهة بحجم 0.4 millimeter لطباعة الرف.

استخدم خيوط البوليلكتيد (PLA)، أو بولي إيثيلين تيريفثالات الجليكول (PETG)، أو أكريلونتريل بوتادين ستيرين (ABS) العامة مع نسبة تعبئة 100%. اضبط ارتفاع الطبقة على 0.1 millimeter وقم بتفعيل خاصية تنعيم السطح. عدل إعدادات الطباعة لضمان إحكام منع تسرب المياه والاستقرار الميكانيكي.

اختبر الحوامل للتأكد من مقاومتها للتسرب قبل استخدامها للمرة الأولى. املأ الخزان المطبوع بـ 70% ethanol لاختباره قبل الاستخدام. قم بإجراء عملية الطرد المركزي لفترات زمنية متزايدة تدريجياً للتأكد من عدم وجود تسريب أو تلف هيكلي.

بعد الاختبار الناجح باستخدام الغراء، قم بتجميع مكونات الخزان الأساسي معاً لتكوين وحدة محكمة الإغلاق. قم بتلقيح escherichia coli، أو سلالة E.Coli المحولة في ثلاثة إلى خمسة مليلتر من مرق الليسوجين، أو وسط LB، الذي يحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. قم بتحضين المزرعة لمدة تتراوح من 12 إلى 16 ساعة عند 37 °C مع الرج.

قم بإجراء الطرد المركزي عند 2000 G لمدة 10 دقائق لحصاد الخلايا. تخلص من الرايق. أضف 250 µL من محلول إعادة التعليق إلى الراسب.

ثم قم بإعادة تعليق الراسب تماماً عن طريق الرج الدوامي (vortexing) أو باستخدام الماصة. أضف 250 µL من محلول التحلل (lysis buffer). واخلط بلطف عن طريق قلب الأنبوب من أربع إلى ست مرات أو عن طريق هز طبق الـ 24 بئراً.

أضف 350 µL من محلول التحييد المنظم وامزجه. لاحظ تكوّن راسب أبيض للتأكيد على نجاح عملية التحييد. أضف محلول التحلل المنظم إلى أنبوب يحتوي على مسحوق ثاني أكسيد التيتانيوم.

أضف نسبة حجم إلى كتلة تبلغ 2:1. أضف 250 µL من معلق ثاني أكسيد التيتانيوم إلى المستخلص الخلوي، ثم اخلطه عن طريق رج الأنبوب.

أضف 350 µL من محلول التحييد المنظم وامزج جيداً. قم بالطرد المركزي عند 2000 G لمدة 10 دقائق. لاحظ ترسب كتلة الخلايا بالكامل في وجود ثاني أكسيد التيتانيوم وظهور السائل الطافي شفافاً تماماً.

في حالة عدم وجود ثاني أكسيد التيتانيوم، لاحظ وجود رواسب متبقية في السائل الطافي. اجمع السائل الطافي دون تحريك الراسب وانقله إلى عمود الارتباط. ضع أعمدة ارتباط DNA في طبقة حامل الأعمدة الموجودة في الحامل.

ثبّت أغطية الأعمدة في الفتحات المخصصة لها لتأمينها أثناء عملية الطرد المركزي. ضع أعمدة التنقية أو الترشيح في طبقة أعمدة الترشيح مباشرة فوق أعمدة الربط. انقل المستخلص الخلوي المُحيّد والمُحضّر إلى أعمدة الترشيح.

ضع الرف المجمع في دوار لوحي ذي دلاء متأرجحة. قم بالطرد المركزي عند 2000 G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. بعد إخراج الرف من جهاز الطرد المركزي، قم بإزالة وطرح طبقة عمود الترشيح.

تخلص من السائل المار من الخزان في حاوية نفايات. أعد تركيب الحامل مع أعمدة الربط. أضف من 500 إلى 700 µL من محلول الغسيل المنظم إلى كل عمود ربط.

قم بإجراء الطرد المركزي عند 2000 G لمدة دقيقة واحدة. تخلص من السائل المتدفق من الخزان وكرر خطوة الغسيل كما تم توضيحه سابقاً. قم بإزالة أعمدة الربط من الحامل وانقلها إلى أنابيب تجميع سعة اثنين مللي لتر.

قم بالطرد المركزي عند 10,000 G أو أكثر لمدة دقيقة واحدة لتجفيف الغشاء. انقل الأعمدة إلى أنابيب نظيفة سعة 1.5 milliliter. أضف 50 µL من محلول الاستخلاص المنظم أو الماء مباشرة إلى الغشاء، واترك الأعمدة لتحضن لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

قم بالطرد المركزي عند 10,000 G أو أعلى لمدة دقيقة واحدة لاستخلاص الـ DNA. لم يظهر إجمالي إنتاج البلازميد أي فرق معنوي بين الطريقة التقليدية والاستخلاص باستخدام تكوينات الرفوف. كما تم الحفاظ على تأكيد البلازميد مع توزيعات مماثلة للأشكال المسترخية والمستقيمة وفائقة الالتفاف.

اقتصر توزيع الصبغة على منطقة النفايات الموجودة مباشرة أسفل الأعمدة المحملة، مع عدم اكتشاف أي إشارة مرئية في الآبار المجاورة أو على أطراف الأعمدة المجاورة، مما يشير إلى أن تصميم الرف يقلل من احتمالية التناثر والانتقال بين الأعمدة. تم اكتشاف التضخيم فقط في النواتج المستخلصة من الأعمدة التي أضيف إليها مضخم الحمض النووي (amplicon). تتيح هذه الجسيمات للباحثين الحصول على DNA بلازميدي عالي الجودة للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك الاستنساخ، والتسلسل، وتحليل PCR.

إن أهم اعتبار عند تنفيذ هذا البروتوكول هو منع التلوث الخلطي من خلال الحفاظ على خزان مطبوع ثلاثي الأبعاد، محكم ضد التسرب، وغير فائض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه الرفوف بعد اتباع هذا الإجراء في أي تحليل لاستخلاص الأحماض النووية القائم على الأعمدة.