اكتشاف الشيخوخة باستخدام الضوء المنعكس في الجزء الدهني من الأوعية الدموية العضلية

ندرس شيخوخة الخلايا الدهنية عبر مخازن الدهون المختلفة والحالات الأيضية مثل السمنة وفرط الإنسولين. اختبارات SABG التقليدية القائمة على برايتفيلد لا تسمح فعليا بالتعدد المتعدد وهي ذاتية جدا. بروتوكولنا الجديد أقل ذاتية ويسمح بالتعدد المتعدد (multiplexing).

للبدء، استرجع الأنبوب الذي يحتوي على نسيج دهني بشري. قم بتجانس 10 جرامات من نسيج دهني وإضافته إلى أنبوب يحتوي على إنزيم كولاجيني من النوع الأول بنسبة 0.05٪ للحصول على حوالي مليون خلية كسر وعائي في العضلات البثية، أو SVF. أليكوت 500,000 خلية في كل أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مليليتر.

أضف ملليتر واحد من 2٪ بارافورمالديهيد إلى الأنبوب لتثبيت الخلايا. ثم حضن على هزاز في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. استخدم الطرد المركزي بحرارة 600G لمدة 10 دقائق وأزل السوبرناتانت.

حضر محلول تلوين X-Gal باستخدام مجموعة التلوين بيتا-جالاكتوسيداز الخاصة بالشيخوخة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. أضف ملليتر واحد من محلول التلوين في ثلاثة أنابيب جديدة. واضبط الرقم الهيدروجيني إلى خمسة وستة وثمانية باستخدام محاليل هيدروكسيد الصوديوم الضرس أو مولة واحدة.

استخدم جهاز قياس الرقم الهيدروجيني المعاير للتحقق من الرقم الهيدروجيني. أضف محلول التلوين X-Gal المعدل حسب الرقم الهيدروجيني إلى كل أنبوب من الأنابيب الموسومة التي تحتوي على 500,000 خلية. حضن عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بدون ثاني أكسيد الكربون.

قم بطرد المركز على الخلايا بحرارة 600G لمدة 10 دقائق. بعد إزالة السوبرناتان، اغسل الخلايا ب PBS. واستخدموا الطرد المركزي مرة أخرى عند 600G لمدة 10 دقائق.

بمجرد إزالة الفائق، لتحديد الخلايا البطانية داخل SVF غير المتجانس، قم بحضانة الخلايا ب CD31 خاص بالخلايا البطانية أو التحكم في الأجسام المضادة الأولية IgG عند أربع درجات مئوية خلال الليل. اغسل الخلايا ثلاث مرات ب 0.1٪ PBST لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز لإزالة الجسم المضاد الأولي غير المرتبط. وجهاز الطرد المركزي بحرارة 600G لمدة 10 دقائق.

بعد التخلص من السوبرناتانت، حضن الخلايا بجسم مضاد ثانوي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز. استخدم جهاز الطرد المركزي بحرارة 600 جرام لمدة 10 دقائق لإزالة محلول صبغ الأجسام المضادة الثانوي. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBST ثم الطرد المركزي كما أوضح سابقا.

أعد تعليق الخلايا في تركيب مضاد التلاشي. قم بتثبيت تعليق الخلية على شرائح المجهر وتجيب طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لتثبيت الخلايا. في اليوم التالي، أضف 100 ميكرولتر من 100٪ جليسرول.

ضع غطاء فوق الطلاء وأغلقه بطلاء الأظافر. ضع الشريحة المعدة على منصة المجهر الكونفوكلي. في واجهة برنامج المجهر، اختر خيار مسار الضوء واضبط إعداد مقسم الشعاع إلى T90R10.

بعد ذلك، تحقق من قيم طول الموجة القطع للمرايا ثنائية اللون الثانوية، أو SDMs، في إعداد المرآة. في قائمة الكاشف، انقر على خيار اختيار الصبغة والكاشف لتعيين القنوات وأطوال موجات الإثارة. ثم قم بتعيين قيم نسبة شدة طاقة الليزر لكل ليزر محدد في نطاق 10 إلى 15٪. في قائمة السلسلة، تحت قسم LSM، قم بتبديل خيار Z إلى التشغيل. اضبط حجم خطوة Z على الحد الأمثل للنظام وهو 0.74 ميكرومتر.

بعد ذلك، تحت قائمة قسم Z، أدخل قيمة بدء حقل الإدخال وحدد مكدس Z بناء على إشارة الغشاء لالتقاط حجم الخلية بالكامل. تحت لوحة Acquire، أدخل اسم الملف وموقع حفظ الملف في حقل إدخال LSM. ثم اضغط على LSM Start لبدء اكتساب الصورة.

وحفظ الملفات بصيغة المجهر الأصلية. بعد الاستحواذ، استخدم أسهم التنقل Z للتحقق من توزيع الإشارة والتوزيع البؤري للأصباغ المختلفة عبر كامل مجموعة Z. قم برفع ملف OIR المحفوظ إلى الصورة J.In نافذة خيارات استيراد التنسيقات الحيوية المنبثقة، ثم اضغط على موافق.

انقر على قائمة الصور لفتح الملف. ومن الخيارات المنسدلة، اختر اللون، ثم خيار تقسيم القنوات لفتح القنوات المختلفة كنوافذ منفصلة. بعد ذلك، قم بضبط تباين السطوع وتحسين قيم LUT باستخدام خيار التعديل في قائمة الصورة لتحسين التصور البصري.

استخدم شريط التمرير على محور Z في أسفل الإطار لعبور الأقسام البصرية والتحقق من ميزات الخلوية في جميع أنحاء المجموعة. في قائمة الصورة، اختر Stack. ثم اختر دالة مشروع Z لتوليد إسقاطات شدة مجمعة للصورة الكونفوكال ثلاثية الأبعاد.

في مربع حوار إسقاط Z، حدد نطاقات البداية والإيقاف. اختر نوع العرض واضغط على حسنا للحصول على الصورة المركبة النهائية ثنائية الأبعاد. بعد ذلك، انتقل إلى قائمة الصور.

اختر خيار النوع لضبط نوع الصورة إلى 16-بت. ثم حفظ الصور وصدرها كملفات TIF 16-بت. استيراد الصور المحفوظة إلى إصدار CellProfiler 4.2.8 لتقسيم الخلايا تلقائيا، وقياس شدة الضوء المنعكس لكل خلية، وتصدير قيم قياس الشدة إلى جدول بيانات.

في جدول البيانات، حدد عتبة إيجابية بيتا-جالاكتوسيداز المرتبطة بالشيخوخة كمجموع متوسط شدة الضوء المنعكس لحالة pH 8 بالإضافة إلى ثلاثة انحرافات معيارية. صنف الخلايا في حالة pH 6 على أنها موجبة بيتا-جالاكتوسيداز مرتبطة بالشيخوخة إذا تجاوزت قيم شدتها العتبة المحددة. أنتج تلوين بيتا-جالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة المنعكس في خلايا SVF البشرية أنماطا واضحة وقابلة للتكرار عبر ثلاثة مستويات حموضة.

عند درجة الحموضة 5، أظهرت معظم الخلايا إشارة قوية بسبب النشاط العالي للإنزيمية الداخلية. عند القيمة القياسية للاختبار لدرجة الحموضة 6، انخفضت شدة الإشارة وترددها، مما سمح بالتعرف الدقيق على خلايا بيتا-جالاكتوسيداز المرتبطة بالشيخوخة. عند درجة الحموضة 8، كانت الإشارة ضئيلة، وكان هذا بمثابة نقطة أساس لتحديد عتبة الإيجابية.

أظهرت اختبارات حساسية الكشف أن تصوير الضوء المنعكس تفوق على برايت فيلد في جميع حالات الرقم الهيدروجيني. عند درجة الحموضة 5، أظهر الضوء المنعكس ترسبات X-Gal قوية، بينما التقط برايتفيلد أكبر الرواسب فقط. عند الرقم الهيدروجيني 6، حدد الضوء المنعكس خلايا إيجابية كانت ضعيفة جدا أو منتشرة بحيث لا يمكن رؤيتها في برايتفيلد.

عند درجة الحموضة 8، رصد تصوير الضوء المنعكس إشارة ضئيلة، متوافقة مع انخفاض النشاط الإنزيمي، متفوقا على برايتفيلد في تحديد ترسيب X-Gal عند مستويات نشاط متوسطة وأدنى. بشكل عام، يدمج هذا السير في تصوير الضوء المنعكس الكشف المتزامن عن علامات بيتا-جالاكتوسيداز المرتبطة بالشيخوخة المعتمدة على الرقم الهيدروجيني والعلامات المعتمدة على الفلورة، مثل CD31، مما يسهل تقييمات الشيخوخة متعددة الميزات بدقة خلية واحدة ضمن مجموعات SVF غير المتجانسة. يتيح هذا البروتوكول قياسات نشاط SABG الحساسة والكمية مع السماح في الوقت نفسه بعلامات الشيخوختة الأخرى، وكذلك علامات خلوية أخرى.

التحدي الرئيسي، أعتقد، هو الإعداد الأولي للمجهر. ولكن بمجرد تحسين ذلك، يمكنك استخدام نفس معايير الاستحواذ عبر التجارب. يمكن للدراسات المستقبلية دمج هذا الاختبار مع مؤشرات تحت الخلوية الأخرى لمعرفة كيف يرتبط SABG بالعمليات الخلوية المختلفة.