الوسم الأيضي للنسخ الناشئة في تكويث الأجنة المبكر لزينوبوس

في هذه الدراسة، نبحث في كيفية حدوث تنشيط الجينات الزيجوتية والتنظيم الانتقالي خلال تكوين جنين زينوبوس المبكر. تكافح الطرق الحالية للكشف عن النصوص الزيجوتية المنشطة حديثا التي تصدر كميات وفيرة من الحمض النووي الريبي الأمومي. يقوم هذا البروتوكول بتصنيف وثراء النسخ الناشئة.

للبدء، ضع غرفة الحقن المجهري تحت ميكروسكوب ستيريو وأضف ملليتر واحد من محلول فيكول إلى الحجرة. احصل على أجنة Xenopus laevis المخزنة في محلول MMR معدل بعلامة 0.1X. استخدم ماصة نقل بلاستيكية لنقل 20 جنينا أو أكثر إلى مركز غرفة الحقن الدقيقة.

جهز إبرة الحقن عن طريق قطع طرف إبرة زجاجية دقيقة باستخدام الملقط. ضع الإبرة عموديا بحيث يكون الطرف مواجها للأسفل وحمل 0.5 ميكرولتر من 5-إيثينيلوريدين 50 مللي موتر أو 5 ميغاوات EU باستخدام ماصة P2 مع رأس ميكرولودر. ثبت الإبرة على جهاز تحكم دقيق.

باستخدام مصنة P10، ضع 10 ميكرولترات من زيت الهالوكربون على ميكرومتر مسرح موضوع تحت مجهر ستيريو. لمعايرة الحجم، اضغط على دواسة القدم الدقيقة وحقن قطرة في زيت الهالوكربون على الميكرومتر. اضبط الضغط ووقت الحقن على الحقن الدقيق حتى يصبح قطر القطرة 0.27 مليمتر.

امسك الجنين ذو المرحلة الخلوية الواحدة بالملقط وتحكم في الإبرة باستخدام المعالج الدقيق لحقن 10 نانولترات من 50 مللي متر 5 EU. انقل الأجنة المحقونة إلى طبق زجاجي جديد يحتوي على محلول فيكول وحضن لمدة ساعة. أزل محلول Ficoll وأضف محلول XMMR 0.1. فحص الأجنة بصريا أثناء التطور وإزالة أي أجنة غير طبيعية إذا لزم الأمر.

نقل 10 أجنة في المرحلة التطورية المطلوبة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مليليتر. أزل أي وسط متبقي من الأنبوب، وقم بتجميد الأجنة في النيتروجين السائل، وتخزينها في فريزر بدرجة حرارة ناقص 80 درجة مئوية. ثم استخرج إجمالي الحمض النووي الريبي من الأجنة، وقياس تركيزه باستخدام مجموعات تجارية.

لعمل تفاعل نقرة بسعة 50 ميكرولتر، اخلط المكونات المعروضة في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليتر. حضن خليط التفاعل على جهاز نوتاتور في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. الآن أضف الجليكوجين، وأسيتات الأمونيوم، والإيثانول المبرد إلى كل خلطة تفاعل.

اخلط جيدا عن طريق استخدام الماصات خمس مرات. حضنه طوال الليل في فريزر بدرجة حرارة ناقص 80 درجة مئوية. بعد الحضانة طوال الليل، قم بالطرد المركزي عند حرارة 13,000 جرام لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية، ثم إزالة المادة الفائقة دون إزعاج الحبيبات.

اغسل الحبيبة مرتين بسعة 700 ميكرولتر من 75٪ إيثانول. بعد الطرد المركزي والتخلص من السوبرناتينت، جفف الحبيبة في الهواء على درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى عشر دقائق وأعد تعليقها في 10 ميكرولتر من ماء خال من RNase. وزع خمسة ميكرولترات من الخرزات المغناطيسية المغطاة بالستريبتافيدين في أنبوب جديد بسعة 1.5 مليليتر.

أضف تسعة ميكرولترات من محلول الغسيل 2 إلى الخرزات وامزج جيدا. ضع الأنبوب على رف مغناطيسي لمدة دقيقتين. أزل المادة الفائقة وكرر الغسلة مرتين إضافيتين.

ثم أعد تعليق الخرزات في خمسة ميكرولتر من مخزن الغسيل 2. حضر خليط رئيسي في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ميكرولتر. أضف 15 ميكرولتر من الخليط الرئيسي إلى كل أنبوب يحتوي على عينة RNA.

ضع الأنبوب على كتلة حرارية وحضنه على درجة حرارة 69 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، ضع الأنبوب على الثلج. ثم أضف خمسة ميكرولترات من الخرزات المغسولة مسبقا إلى كل عينة RNA، وحضن على جهاز نوتاتور في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.

اغسل مركبات الحمض النووي الريبي الصغير خمس مرات باستخدام مخزن غسيل 50 ميكرولتر 1، تليها خمس غسلات بمخزن غسيل 50 ميكرولتر 2. أعد تعليق الخرزات في مخزن غسل بخمسة ميكرولتر 2. استخدم الخرزات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي الأوروبي الناشئ مباشرة لتخليق حمض الديوكسي ريبونوكليك المكملة وتحضير المكتبة.

تم اكتشاف زيادة عدد الجينات المنشطة تفريقيا أثناء تنشيط الجينوم الزيجوي عند مقارنة النسخ الناشئ بعد ست ساعات من الإخصاب مع ذلك في خمس ساعات بعد التخصيب، مع زيادة إضافية عند سبع ساعات بعد التخصيب، وثماني ساعات بعد التخصيب، وتسع ساعات بعد التخصيب. تم اكتشاف جينات الزيجوت على مستويات أعلى، وفي أوقات أبكر في بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الأوروبية الناشئة مقارنة بإجمالي بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي. يعد التنقية الدقيقة للحمض النووي الريبي الناشئ الموسوم أيضيا هو العامل الأهم لضمان الحساسية والخصوصية في هذا البروتوكول.

يمكن تحليل الحمض النووي الريبي الناشئ الموسوم بالاتحاد الأوروبي المنتج باستخدام هذا البروتوكول بشكل أكبر كيميائيا حيويا في المختبر. يتيح هذا النهج الدراسات المستقبلية من دراسة أنماط تنشيط الجينوم، والتعبير الجيني الخاص بالنسيج، والآليات التنظيمية كحل خلوي واحد.