بروتوكول موحد لتحفيز الشيخوخة المبكرة الناتجة عن الإجهاد في الخلايا الميلانوسكستية البشرية الأولية باستخدام بيروكسيد تيرت-بيوتيل

يركز بحثنا على استقصاء النمط الظاهري للشيخوخة في الخلايا الميلانية ومساهمته في شيخوخة الجلد الخارجية. تستخدم نماذج الشيخوخة القائمة على الخلايا الليفية، وهي تفشل في رصد البيولوجيا الخاصة بالخلايا الميلانية. يهدف هذا البروتوكول إلى تحفيز الإجهاد التأكسدي بوساطة tBHP في الخلايا الميلانية البشرية الأولية.

للبدء، قم بتجميع الكواشف المطلوبة. بعد إذابة الخلايا الميلانينية وتجميدها والسماح لها بالتعافي لمدة ثلاثة أيام، تأكد من وصول الخلايا إلى درجة تلاقي تتراوح بين 80 إلى 90% في يوم الاستزراع. قم بشفط الوسط من القارورة.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام DPBS. أضف 2 mL من محلول trypsin EDTA لفصل الخلايا. ضع القارورة في الحاضنة لمدة خمس دقائق عند 37 °C مع 5% carbon dioxide.

انقر بلطف على القارورة. وتحت المجهر، افحص الخلايا للتأكد من انفصالها تماماً. أضف 1.5 ضعف حجم مثبط التريبسين لإيقاف التفاعل.

انقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. خفف المعلق باستخدام DPBS ليصل الحجم النهائي إلى 10 ملليلتر. قم بطرد معلق الخلايا مركزياً بقوة طرد مركزية نسبية قدرها 100 لمدة خمس دقائق.

قم بشفط السائل الطافي وإعادة تعليق كتلة الخلايا في الوسط الغذائي حتى الوصول إلى الحجم المطلوب. قم بزراعة 600,000 خلية في كل طبق بقطر 10 سنتيمتر للأطباق المعالجة بـ tert-Butyl hydroperoxide أو tBHP. وازرع 400,000 خلية في كل طبق لأطباق التحكم.

قم بتحضير محلول عمل بتركيز 10 millimolar من المخزون الخاص بـ tBHP باستخدام DPBS أو الوسط الغذائي. أضف 100 micromolar من tBHP إلى الخلايا لمدة ساعة واحدة لكل معالجة. حرك الطبق ذهاباً وإياباً لتوزيع tBHP بالتساوي في جميع أنحاء الوسط.

ضع الخلايا في الحاضنة لمدة ساعة واحدة بالضبط عند 37 °C مع 5% carbon dioxide. قم بشفط الوسط الإنشائي لإنهاء المعالجة بـ tBHP. اغسل الأطباق مرتين باستخدام DPBS المسخن مسبقاً عند 37 °C.

أضف الحجم المناسب من الوسط الغذائي الطازج إلى الأطباق. ضع الأطباق في الحاضنة واترك الخلايا لتتعافى لمدة أربع ساعات على الأقل قبل العلاج التالي. كرر إجراء العلاج لاحقاً في نفس اليوم من أجل العلاج الثاني.

استمر في نظام العلاج حتى اليوم الرابع، ثم حافظ على الخلايا في المزرعة حتى اليوم التاسع لتقييم علامات الشيخوخة. قم بعدّ الخلايا المعالجة بـ tBHP والخلايا الضابطة. أعد زراعتها بنفس الكثافة الأولية، أو إذا تم الحصول على أقل من 600, 000 خلية من الأطباق المعالجة بـ tBHP، فأعد زراعة جميع الخلايا التي تم جمعها.

قم بعدّ الخلايا في الأيام الرابع والتاسع والخامس عشر من الزرع. وفي اليوم التاسع، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. ثم قم بتثبيت الخلايا باستخدام 2%formaldehyde و0.4%glutaraldehyde.

اغسل الخلايا المُثبَّتة مرتين باستخدام PBS. قم بتحضين الخلايا المُثبَّتة في محلول صبغ عند pH 6. غطِّ الطبق لحمايته من الضوء، ثم حضنها لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية في غياب ثاني أكسيد الكربون.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. وباستخدام المجهر الضوئي، قم بتصوير وعد الخلايا المصبوغة باللون الأزرق، ثم اقسم هذا العدد على إجمالي عدد الخلايا ضمن نفس الحقل.

يتم التعبير عن النتائج كنسبة مئوية للخلايا الموجبة. بعد تحفيز الإجهاد التأكسدي، أدى العلاج بـ tBHP إلى تقليل تكاثر الخلايا الميلانينية بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعات الضبط. حيث وصلت الخلايا المعالجة إلى 1.4 فقط من مضاعفات عدد السكان التراكمية، أو cPDL، بحلول اليوم التاسع، بينما وصلت مجموعات الضبط إلى 3.1 cPDL.

وبحلول اليوم 15، استقرت الخلايا المعالجة عند 1.9 cPDL، بينما توسعت خلايا المجموعة الضابطة لتصل إلى 5.1 cPDL. وأظهرت الخلايا الميلانية المعالجة بـ tBHP زيادة في مساحة سطح الخلية مقارنة بالمجموعات الضابطة في جميع النقاط الزمنية المقاسة، مع استمرار التضخم حتى اليوم 15، وهو ما يتوافق مع المورفولوجيا المتضخمة والمسطحة للخلايا الهرمة. كما أظهرت الخلايا الميلانية المعالجة بـ tBHP زيادة في نشاط بيتا-جالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة، أو نشاط SA-beta-galactosidase، حيث بلغت نسبة الخلايا الإيجابية 32% مقارنة بـ 3% في المجموعات الضابطة.

كان الارتفاع في إيجابية SA-beta-galactosidase متسقاً مع النمط الظاهري للشيخوخة. وأظهر تحليل التألق المناعي زيادة في مستويات gamma-H2AX في الخلايا الميلانينية المعالجة بـ tBHP مقارنة بالمجموعات الضابطة. كما أظهرت الخلايا المعالجة إشارة gamma-H2AX أقوى من المجموعات الضابطة.

أظهر تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي زيادة في تعبير عوامل النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة، حيث سجل الإنترلوكين-8 أكبر زيادة. بينما أظهر الإنترلوكين-6 وماتريكس ميتالوبروتينيز-1 زيادات متوسطة. وأكد تحليل لطخة ويسترن حدوث تحفيز الشيخوخة.

أظهر Lamin B1 انخفاضاً ملحوظاً في الخلايا الميلانينية المعالجة بـ tBHP مقارنة بمجموعات الضبط. كما انخفضت مستويات بروتين retinoblastoma المفسفر في الخلايا الميلانينية المعالجة بـ tBHP مقارنة بمجموعات الضبط. وأدت المعالجة بـ tBHP إلى زيادة التعبير النسخي لكل من p16 و p21 في الخلايا الميلانينية.

يتيح هذا النموذج للباحثين دراسة كيفية تأثير الخلايا الميلانينية الهرمة على التصبغ والتواصل مع الخلايا المحيطة عبر عوامل SASP الالتهابية. ويكمن التحدي في هذا البروتوكول في التوقيت الدقيق؛ حيث يجب تطبيق tBHP مرتين يومياً مع وجود فاصل زمني لا يقل عن أربع ساعات.

باتباع هذا البروتوكول، يمكن توصيف الشيخوخة الخلوية باستخدام صبغ بيتا-جالاكتوزيداز المرتبط بالشيخوخة، والفلورة المناعية، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)، واللطخة الغربية لعلامات الشيخوخة المحددة.