توصيف بنية ووظيفة غشاء الدهون والبروتين باستخدام طبقات مزدوجة لواجهة القطرات

في هذا العمل، ندرس كيف تؤثر الخصائص الفيزيائية والكهربائية لأغشية الدهون وبيئتها على توصيل الأيونات في أنظمة نماذج الطبقات الثنائية لواجهة القطرات. لا تستكشف الفيزيولوجيا الكهربائية التقليدية باستخدام الرقعة الفيزياء الحيوية للأغشية على نطاق أكبر، لكن هذه المنصة الواحدة تلتقط كل من نشاط القناة الواحدة ومناطق الغشاء الأكبر حجما على مقياس المليمتر لدراسة الفيزياء الحيوية للغشاء بشكل أوسع. للبدء، حضر أقطاب الأسلاك الفضية المطلية بالأجاروز المكلور ومحاليل الحويصلات الدهنية للتجارب الفيزيولوجية الكهربائية.

لتكوين طبقة مزدوجة لواجهة القطرات، ضع طبق بتري شفاف في الأسفل على منصة المجهر المقلوب. املأ الطبق بزيت الألكاني مثل 100٪ سداسي الكان، حتى عمق حوالي خمسة مليمترات. بعد تثبيت الأقطاب الكهربائية على مسرح رأس مشبك الرقعة وحامل الأقطاب الأرضي، استخدم أدوات التحكم في الميكرو مانبيولاتور لخفض طرفي الكرة المطلية بالأجاروز إلى عمق حوالي 2.5 ملم تحت سطح الزيت، لتجنب الحركة السريعة لمنع الاصطدام بطبق بتري.

اضبط تركيز المجهر حتى تصبح طرفي الكرة وطبقات الأجاروز واضحة تماما. ضع الأقطاب بالقرب من حافة مجال الرؤية، بحيث يمكن ملاحظة كلاهما في نفس الوقت. باستخدام ماصة معايرة بسعة ميكرولترين، قم بسحب حوصلات الدهون DPhPC المبثقة والمطعمة بجراميسيدين A. قم بتوزيع 250 نانولتر من التعليق ببطء مباشرة على كل طرف كروي مطلى بالأجاروز باستخدام طرف ماصة منفصل لكل منها دون لمس قشرة الأغاروز.

دع القطرات تنتشر على سطح الأغاروز وتتدلي بشكل واضح للأسفل بسبب الجاذبية وانخفاض التوتر السطحي، مكونة شكل قطرة معلقة. لاحظ الترهل من الجانب عبر جدار صحن بتيري إذا كان الجو خاليا. بعد خمس دقائق، اهتز بلطف على طاولة مضادة الاهتزاز لتقييم القطرة.

تأكد من أن القطرات المتدلية تتحرك بتأخير طفيف بالنسبة لحركة الأقطاب، مما يشير إلى تكوين قطرات أحادية الطبقة الدهنية المغطاة بالكامل. إذا لم يلاحظ هذا السلوك، انتظر دقيقتين إلى ثلاث دقائق إضافية وكرر التقييم. تأكد من توصيل المجهر، طاولة مضادة الاهتزاز، قفص فاراداي، المضخم، الرقمي، مولد الدوال، والكمبيوتر بأرضية مشتركة.

ترتيب وصلات الأجهزة وفقا لدليل إعداد الشركة المصنعة وقم بإعداد الإعداد الكهربائي والبصري الأساسي، باتباع التعليمات التفصيلية لتجارب الطبقتين في واجهة القطرات. قم بتكوين مولد دوال خارجي أو قناة إخراج برنامج الاستحواذ لتوليد موجة جهد مثلث بجهد 10 هرتز و10 ميلي فولت. تأكد من السعة والتردد على راسم الإشارة المتصلة وفي برنامج الاستحواذ.

بعد أن ترهل القطرات لمدة تقارب 10 دقائق، استخدم الميكرو مانبولايترز لجعل القطرتين يتلامسان بلطف. شغل شكل الموجة المثلثية بتردد 10 هرتز و10 ميلي فولت وراقب استجابة التيار السعوي في برنامج الاستحواذ. اضبط منطقة تلامس القطرة عن طريق تحريك الأقطاب قليلا حتى تكون استجابة التيار السعوي من الذروة إلى الذروة للموجة بين حوالي 100 و200 بيكوأمبير.

أو أن مساحة التلامس لا تزيد عن حوالي ربع قطر القطرة. انتظر تكوين الطبقة الثنائية التلقائي الذي يشار إليه كهربائيا باستجابة تيار سعوية متوسع من قمة إلى ذروة، وبصريا بانعكاس داخلي متزايد مع مظهر بيضاوي في منطقة التلامس. تأكد من أن الطبقات الثنائية الدهنية النقية تظهر هضبات تيار مستطيلة استجابة لمحفز الجهد المثلث، بينما تظهر طبقات الثنائي المغذية بالجرامسيدين A هضبا مائلة، تعكس التوصيل الأيوني الجماعي.

بمجرد تأكيد الاستجابات المستقرة السعوية أو التوصيلية، يتم إيقاف شكل الموجة المثلثية والسماح لطبقة الواجهة القطرية بالتوازن لمدة لا تقل عن 15 دقيقة قبل تطبيق بروتوكولات التحفيز. في برنامج التقاط الفيديو، اضبط معدل الإطارات على الأقل 20 إطارا في الثانية. اختر إعدادات الكاميرا والعدسة الموضوعية المناسبة.

بعد ذلك، اضغط على الحصول واختر بروتوكول جديد. في تبويب وضع الاستحواذ، اختر التحفيز الحلقي. يحدد كل تجربة ويمنح الجولة الواحدة لعدد الضربات.

اضبط مدة المسح إلى أربع ثوان أطول من إجمالي مدة التجربة، مما يسمح بخط أساس قبل وبعد التحفيز لمدة ثانيتين. اضبط معدل العينة بين خمسة إلى 10 كيلوهرتز. في تبويب المدخلات، قم بتعيين قناة التسجيل إلى المدخل الحالي.

ثم، في تبويب المخرجات، قم بتعيين قناة التحفيز لخرج الجهد الذي يتحكم في الأقطاب. افتح تبويب الموجة. في العمود A، اضبط النوع على Step، والمستوى الأول ومستوى الدلتا على صفر ملي فولت، ومدة البداية على 2000 مللي ثانية لتحديد خط أساس للتحفيز المسبق.

في العمود B، اضبط نوع النبضة لتسهيل النبضات المزدوجة. حدد قيم مدة الجهد الأولى وسعة جهد المستوى الأول وضبط معدل القطار لتحديد فترة النبضات الزمنية المقابلة لدورة العمل المستهدفة. اضبط عرض النبضة إلى 100 مللي ثانية.

في العمود C، لانخفاض النبض المزدوج، اضبط النوع على Pulse بنفس السعة ومدة النبضة. اضبط معدل القطار لتحقيق دورة العمل المنخفضة المطلوبة وضبط عرض النبضة. بعد ذلك، في العمود D، قم بتكوين معلمات ما بعد التحفيز مطابقة لخط الأساس للتحفيز المسبق.

راجع البروتوكول واحفظه باسم وصفي. ابدأ تسجيل الفيديو وابدأ فورا في التقاط الكهرباء والتحفيز بالنقر على زر التسجيل في كل برنامج. خلال أول 60 ثانية من التحفيز، لاحظ أن التيار يزداد وقد يصل إلى هبوط.

خلال آخر 60 ثانية، لاحظ أن التيار ينخفض. في نهاية البروتوكول، توقف الاكتساب الكهربائي وتسجيل الفيديو في نفس الوقت. وأخيرا، قم بإجراء المعالجة اللاحقة لاستخراج مساحة الغشاء وحساب التيار والمساحة والتدفق المعياري من بيانات التصوير والكهرباء.

التقطت الصور المتسلسلة انزلاق الطبقتين العفوي وتمدد المنطقة عندما تلامست قطرتان متدليتين. تم استخدام الانعكاسات الداخلية المضيئة على شكل بيضاوي عند تلامس القطرات لتقدير قطر الطبقة الثنائية ومساحة الغشاء مع مرور الوقت. تم توفير تسهيل النبضات المزدوجة من صفر ثانية إلى 60 ثانية وانخفاض النبضات المزدوجة من 60 ثانية إلى 120 ثانية باستخدام نبضات مدتها 100 مللي ثانية.

تم تسجيل الاستجابات الحالية الممثلة خلال الدورات وأنماط التحفيز. يظهر التيار الطبيعي للطبقات الثنائية المغذية بالجراموسيدين A في زيوت الهيكساديكان والدوديكان/الهيكساديكان خلال تسهيل النبض المزدوج وانخفاض النبض المزدوج. أظهرت مساحة الغشاء الموحدة التي تم قياسها عند 30 نقطة زمنية تطورا مشابها في كلا الظروفين النفطية رغم اختلاف التيارات.

فصل التدفق الطبيعي التغيرات المستقلة عن المساحة في الموصلية وكان متسقا مع التغيرات في توصيل الغشاء إلى ما بعد التمدد البسيط. أدى التحفيز الممتد لانخفاض النبض المزدوج لمدة تصل إلى 30 دقيقة إلى سلوك طويل الأمد يشبه الاكتئاب في أغشية السداسيكان، لكنه حافظ على تدفق مرتفع في أغشية الدوديكان/السداسي يتوافق مع سلوك يشبه التقوية طويل الأمد. يتيح لنا هذا البروتوكول قياس كيفية تغير بنية الغشاء وتوصيل الأيونات من خلال إعادة هيكلة طبقات واجهة القطرات الكهربائية المدفوعة بالقوة.

يمكن لهذه المنصة دعم العديد من بروتوكولات التحفيز المختلفة في القنوات الأيونية بدون قنوات أيونية، وحتى قنوات قابلة للتمثيل الضوئي لتحسين ديناميكا الغشاء والخصائص الكهربائية. نظرا لأن هذه المنصة القابلة للتعديل تستكشف فيزياء الأغشية على المستوى الكبير والمجهري، فإن التجارب المستقبلية ستتحسن بشكل كبير من خلال استخدام مطيافية الفلورة لفصل نشاط قنوات البروتين عن توصيل المسام الغشائية بشكل أكثر ثقة.