جهاز ميلي فلويديك مزرعة مستمرة لدراسة الإشريكية القولونية تحت ظروف منخفضة ومتقلبة من العناصر الغذائية

يركز بحثي على دراسة كيفية تكيف البكتيريا فسيولوجيا مع الظروف المنخفضة والمتقلبة للمغذيات النموذجية للبيئات الطبيعية. أنظمة الزراعة التقليدية لا تحاكي بشكل جيد ظروف المغذيات الديناميكية المنخفضة، بينما يتيح نظامنا الزراعة في ظل هذه الظروف البيئية ذات الصلة. حضر الزراعة الليلية في اليوم الذي يسبق التجربة.

جهز الزراعة المسبقة بإضافة ستة ميكرولترات من الزراعة الليلية إلى أنبوب يحتوي على ستة ملليلتر من الوسط المعرف الغني الكامل، أو RDM. قسم الخليط بالتساوي إلى أنبوبين زراعة بسعة 15 ملليلتر ووضع عليهما علامة A و B. حضن كلا الأنبوبين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، مع هز عند 200 دورة في الدقيقة. راقب الكثافة البصرية عند 600 نانومتر باستخدام أنبوب B، ولا تتابع حتى تصل الكثافة الضوئية إلى حوالي 0.5.

أثناء الحضانة، جهز وسط RDM المنخفض، وخصص الحجم الكلي عبر الزجاجات لفترات زمنية مختلفة. ثم أغلق كل زجاجة بأغطية مزودة بثلاثة أنابيب. قم بتوصيل ثالث أعرض أنبوب سيليكون بفلتر تهوية بحجم 0.2 ميكرومتر لتبادل الهواء المعقم.

قم بتثبيت أحد طرفي كل أنبوب بريستالتيكي مزود بموصلات قفل لوير ذكرية على أنابيب السيليكون ذات القطر الأصغر. اترك غطاء ورق الألمنيوم على وصلة قفل Luer الذكرية الحرة في الطرف الآخر من أنابيب التبريستاليك حتى تبدأ التجربة لمنع التلوث. ضع الزجاجات والمضخة البريستالتية في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية.

ثبت جميع أنابيب التبريستاليك في قنوات نفس رأس المضخة، لضمان تساوي معدلات التدفق عبر جميع الفلاتر. تخفيف الزراعة المسبقة بنسبة واحد إلى عشرة بإضافة 600 ميكرولتر من الزراعة في أنبوب يحتوي على 5.4 ملليلتر من RDM المنخفض. باستخدام ماصة بسعة ملليتر واحد، أدخل ملليتر واحد من الزراعة المخففة في كل من ستة مرشحات فلوريد بولي فينيليدين بقياس 0.45 ميكرومتر، أو PVDF.

بعد شطف صمامات الفحص أحادية الاتجاه بماء فائق النقي المعقم بالتعقيم، قم بتثبيتها على كل طرف من الفلاتر. قم بإزالة أغطية رقائق الألمنيوم من وصلات الأنابيب. قم بتوصيل كل فلتر بوصلات أنابيب التبريستاتيك.

اضبط معدل التدفق إلى ملليتر في الدقيقة على مضخة التهريج. ضع مقبس نفايات أسفل المرشحات لجمع التدفق، وابدأ التدفق. بعد ساعتين، قم بفصل أحد الفلاتر المتصلة بزجاجة السعة لتر واحد، وفك صمامات الفحص أحادية الاتجاه، ووضع الفلتر في أنبوب طرد مركزي بسعة 50 ملليلتر بحيث يكون المدخل مواجها للأسفل.

الطرد المركزي على 2,000 جرام لمدة دقيقتين. باستخدام قاطع أنابيب معقم، اضغط بلطف عند طرف مخرج الغلاف البلاستيكي لفتح الفلتر. حرر الأسطوانة الداخلية وتخلص من الجزء الذي يحتوي على الغشاء.

اشطف الجدران الداخلية لغلاف الفلتر باستخدام وسط الزراعة المجمع. قس الحجم الكلي المجمع باستخدام ماصة مصلية بحجم خمسة ملليتر. خذ ثلاثة أليكوتات بحجم 100 ميكرولتر من العينة وثبتها بغلوتارالديهايد إلى تركيز نهائي 1.5٪، افصل المرشحات المقابلة في النقاط الزمنية التالية وكرر عملية الجمع.

ضع علامات على العينات المجمعة حسب نقاط الزمنية الخاصة بها. قم بتسمية العينات بصبغة الحمض النووي الفلورية، وعد الخلايا باستخدام قياس تدفق الخلية. مع مرور الوقت، اتبعت عداد الخلايا المحولة في لوغاريتيم 10 مسارات خطية، مما يشير إلى نمو أسي في جميع الظروف.

كانت معدلات النمو حوالي 0.88 في الساعة لحالة RDM بنسبة 0.5٪، و0.64 في الساعة للحالة التي تبلغ 0.25٪، و0.18 في الساعة للحالة التي تبلغ 0.01٪. وصل عدد الخلايا إلى مليار خلية لكل عينة، مما يدل على أن جهاز الزراعة المستمر الميلي فلويد، أو MCCD، يدعم النمو الأسي والعائد العالي للكتلة الحيوية عند تركيزات المغذيات النانوية إلى الميكرومولية. الخلايا التي نمت في 0.5٪ RDM كان لديها متوسط طول خلوي أكبر من الخلايا التي نمت في 0.01٪ RDM.

التحدي الرئيسي أثناء الزراعة منخفضة المغذيات هو الحفاظ على كثافة الخلايا المناسبة لمنع الانسداد وتراكم الضغط واستنزاف العناصر الغذائية. وبعد هذا الإجراء، يمكن جمع الخلايا لتحليل لاحق آخر، بما في ذلك البروتيوميات، والميتابولوميات، وطرق الأوميكس الأخرى. يمكن للدراسات المستقبلية دراسة تكيف الميكروبات مع محدودية وتقلبات العناصر الغذائية من خلال دمج هذا البروتوكول مع تحليل أوميكس كمي.