التحليل الليزوزومي باستخدام LysoTracker للتقييم الكمي لشيخوخة الخلايا في الخلايا الليفية البشرية
يوليو 17, 2026
تقدم هذه المقالة بروتوكول ليزوتراكر للخلايا الحية لقياس إعادة تشكيل الليسوسوم أثناء الشيخوخة في الخلايا الليفية البشرية IMR-90.
ندرس شيخوخة الخلايا وتوصيفها، مع التركيز على كيف يمكن لميزات مثل التغيرات الليسوسومية أن تعمل كعلامات للشيخوخة. غالبا ما تكون علامات الشيخوخة التقليدية قائمة على نقطة النهاية وثنائية، بينما يمكن لتصوير الخلايا الحية قراءة الشيخوختة كإشارة كمية مستمرة عبر الظروف. للبدء، زرع الأرميات الليفية IMR-90 في صفيحة مكونة من 24 بئرا وحضنتها عند حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ حتى تشكل طبقة أحادية تحت التلاصق.
سجل كثافة البذور والوقت بين الطلاء والتلوين الليزوزومي لكل تجربة. سخن متوسط الزراعة الكامل إلى 37 درجة مئوية. حضر محلول عمل من LysoTracker Deep Red بحجم 75 نانومولر في الوسط، وحمه من الضوضاء.
اخلط المحلول العامل بعكس لطيف. اختاروا مجموعات الأرومية الليفية IMR-90 التي تم إعدادها باستخدام طريقة تعريف للتحفيز للشيخوخة قبل الشيخوخة والشيخوخة. تأكيد النمط الظاهري المتقدم في السن من خلال مراقبة خصائص النمو والشكل.
استنشق الوسط المستهلك من كل بئر. أضف محلول LysoTracker العامل بلطف على طول جدار كل بئر، لتجنب التسبب في إزعاج الطبقة الأحادية. حضن الخلايا باستخدام LysoTracker لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في حاضنة ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
خلال الدقائق العشر الأخيرة من حضانة ليزوتراكر، أضف هوشت 33342 مباشرة إلى الآبار عند تركيز العمل الموصى به المصنع وامزج اللوح بلطف. أزل وسط التلوين في نهاية الحضانة وشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS المسخن مسبقا لتقليل التألق الخلفي. بعد الشطف مباشرة، أضف وسط زراعة الفينول الخالي من الفينول الأحمر المسخن مسبقا.
تابع مباشرة إلى تصوير الخلايا الحية، مع الحفاظ على الوقت من تبادل المخزن المؤقتة إلى جمع البيانات متسقا عبر جميع الآبار. ضع علامات على الآبار المتوازية في لوحة الزراعة لتلوين بيتا-جالاكتوسيداز لمقارنة الخلايا عالية السن مع الضوابط قبل الشيخوخة. تصوير كامل بالخلايا الحية لآبار التحقق قبل التثبيت.
سجل إحداثيات المرحلة أثناء التصوير الحي لإعادة تموضع نفس الحقول بعد التثبيت. أضف محلول التثبيت من مجموعة صبغ بيتا-جالاكتوسيداز للشيخوخة والذي يحتوي على 2٪ فورمالديهايد و0.2٪ جلوتارالديهايد إلى الخلايا. غط الطبق بالغطاء وحضن لمدة 10 إلى 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
أزل المثبت وشطف الآبار مرتين باستخدام PBS. ثم أضف محلول التلوين بيتا-جالاكتوسيداز الذي يحتوي على ركيزة X-غال عند درجة حموضة 6 لكل بئر. أغلق اللوحة بطبقة باراغليما للحد من التبخر أثناء الحضانة، ووضع اللوح في حاضنة جاف بدرجة حرارة 37 درجة مئوية بدون ثاني أكسيد الكربون لمدة 12 إلى 16 ساعة.
بعد التثبيت والتلوين، ضع اللوح على مرحلة المجهر وأعد تحديد نفس مجالات التصوير باستخدام إحداثيات المرحلة المسجلة. افحص الآبار تحت مجهر سbrightfield ووثق نمط التلوين. احصل على صور ممثلة لكل حالة وحدد نسبة الخلايا الإيجابية لبيتا-جالاكتوسيداز المرتبطة بالشيخوخة لكل بئر.
أظهرت الخلايا الشيخوة مناطق مضيئة وممتدة مكانيا مخصبة بالليسوسوم شبه النواوي، في حين أظهرت الخلايا الضابطة قبل السن إشارة أقل بشكل عام مع هياكل مثقبة منفصلة. أظهرت ظروف الشيخوخة نسبة أعلى من خلايا بيتا-غال الإيجابية مقارنة بالعناصر الضابطة قبل السن. لوحظ ارتباط قوي بين شدة LysoTracker ومنطقة بيتا-غال الإيجابية المرتبطة بالشيخوخة عبر الآبار المكررة.
كان متوسط شدة LysoTracker داخل القناع الإيجابي أعلى في الثقافات المتقدمة في السن مقارنة بالثقافات قبل العجوز، مما يجعله أقوى مميز على مستوى الحقل بين الحالتين. كانت شدة LysoTracker المتكاملة لكل نواة أعلى أيضا في الثقافات المتقدمة في السن في المجال التمثيلي المعروض. يتيح هذا البروتوكول للباحثين قياس إعادة تشكيل الليسوسوم في الخلايا الحية، مما يوفر قراءة قابلة للقياس لحجم الشيخوخة والتقدم في خلية واحدة.
من المهم الحفاظ على مطابقة إعدادات التلوين والتصوير عبر جميع الآبار، حيث أن مقارنات الشدة صالحة فقط خلال جلسة واحدة. يمكن للدراسات المستقبلية توسيع هذا الإجراء ليشمل نماذج ثلاثية الأبعاد، وأنواع خلايا إضافية، والتحقق عبر أنظمة المجاهر المختلفة وسير العمل.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
Overview
This article presents a live-cell imaging protocol for assessing cellular senescence by quantifying lysosomal remodeling using LysoTracker Deep Red, an acidotropic fluorescent dye. The method provides an indirect, pH-dependent readout of the acidic organelle compartment, serving as a practical correlate of senescence burden in cultured cells, specifically demonstrated in IMR-90 human lung fibroblasts undergoing replicative senescence.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular senescence
- Cell biology
- Live-cell imaging
Background
- Cellular senescence is characterized by stable cell-cycle arrest and distinct phenotypes, including enlarged morphology and altered secretory profiles.
- Senescent cells show pronounced lysosomal remodeling and expansion of the acidic endo-lysosomal compartment.
- Changes in lysosomal acidity and degradative capacity are hallmarks of senescence.
- Traditional senescence assays include SA-β-Gal staining, but live-cell compatible, quantitative methods are needed.
Purpose of Study
- To provide a simple, live-cell imaging protocol for quantifying lysosomal remodeling as a correlate of senescence.
- To demonstrate the use of LysoTracker Deep Red for assessing acidic organelle expansion in senescent cells.
- To offer a quantitative complement to conventional endpoint assays for senescence.
Methods Used
- Culturing and serial passaging of IMR-90 human lung fibroblasts to induce replicative senescence.
- Staining live cells with LysoTracker Deep Red to label acidic organelles.
- Fluorescence imaging to visualize and quantify lysosomal signal intensity and lyso-positive area per cell.
- Optional SA-β-Gal staining on parallel cultures as a confirmatory marker.
Main Results
- Late-passage, senescent cultures exhibited higher LysoTracker signal and larger lyso-positive regions compared to early-passage controls.
- The observed increase in acidotropic dye signal is consistent with expansion of the acidic organelle compartment during senescence.
- The method provides an indirect, quantitative measure of lysosomal remodeling associated with senescence.
Conclusions
- The protocol offers a simple, adaptable approach for live-cell assessment of senescence-linked lysosomal remodeling.
- Results should be interpreted as indirect correlates of lysosomal changes, not direct measures of lysosome number or biogenesis.
- The method can be extended to other cell types or senescence-inducing conditions.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of cellular senescence using LysoTracker-based lysosomal profiling enables early detection of senescence-linked organelle remodeling in human fibroblasts. This live-cell imaging approach provides a scalable, indirect readout of senescence burden, supporting predictive confidence in discovery-stage cell models. Integrating such quantitative, adaptable assays strengthens portfolio triage and mechanistic de-risking in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of senescence-associated organelle remodeling as a functional biomarker.
- Supports biological de-risking by quantifying lysosomal changes linked to cell-cycle arrest.
- Facilitates predictive confidence in cell-based models for target validation.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, live-cell systems for downstream screening of senescence-modulating compounds.
- Delivers quantitative, reproducible readouts of lysosomal signal intensity and area per cell.
- Enables assay standardization and scalability for high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling of senescence in human fibroblasts.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of senescence-modifying interventions.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying cellular remodeling endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
This lysosomal profiling protocol fits within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis testing and quantitative assessment of senescence in cell models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of senescence-linked lysosomal remodeling and pathway clarification.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in live-cell assays.
- Analytics: Delivers image-based measurements of lysosomal signal intensity and area per cell for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains continuity with disease-relevant fibroblast models and senescence endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable, live-cell assay platform for diverse senescence-inducing conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in senescence studies.
- Operational Value: Enables standardization, reproducibility, and scalability in live-cell imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing quantitative, early-stage readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of senescence-modifying candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging and quantitative image analysis.
- Needs access to fluorescence microscopy and compatible analytical software.
- Demands cross-team standardization of staining and imaging protocols.
- Adaptable to various cell types and senescence-inducing stresses with protocol optimization.
- Interpretation is limited to indirect correlates of lysosomal remodeling, not direct lysosome quantification.
