تحديد مرشحي مكافحة السل المحتملين: دليل خطوة بخطوة للتخليق، وتحديد MIC، وتقييم سمية الخلايا في الخلايا الثديية

يركز بحثنا على تطوير والتحقق من أدوية جديدة لمكافحة السل تهدف إلى تطوير استراتيجيات علاجية. يمكن استخدام خط الفحص الظاهري الوقائي في البحث عن أدوية جديدة ضد سلالات الفطرية السلية. للبدء، اجمع المواد الكيميائية المطلوبة وبدأ في تحضير خليط التفاعل باستخدام النسب المعروضة.

حرك خليط التفاعل على درجة حرارة 85 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. استخدم مبخارا دوارا لإزالة المذيب. أضف حوالي 20 ملليلتر من محلول بيكربونات الصوديوم المشبع إلى البقايا.

قم بترشيح هذا التعليق باستخدام ورق فلتر سليلوز نوعي بحجم 11 ميكرومتر لجمع المواد الصلبة المتبقية. قم بإذابة المواد الصلبة المتبقية في 50 ملليتر من الكلوروفورم. استخدم قمع فصل لشطف محلول الكلوروفورم بماء 15 ملليتر ثلاث مرات.

إزالة طبقة الماء في كل مرة. أضف كبريتات الصوديوم اللامائية إلى الطور العضوي لإزالة الماء المتبقي وتجفيفه. بعد تبخير المذيب، اغسل المادة الصلبة الخضراء الناتجة أربع مرات ب 10 ملليلتر من الهكسان الساخن عند درجة حرارة تقارب 50 درجة مئوية.

أضف إلى ملليغرام واحد من المركب 6 ملليتر واحد من خليط واحد لواحد من الأسيتونيتريل والميثانول لتحضير محلول مرقب. قم بتخفيف المحلول الأصلي إلى 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر وتصفيته قبل التحليل. قم بتحميل العينة في نظام HPLC.

استخدم برنامج جمع بيانات الكروماتوغرافيا لجمع البيانات ومعالجتها. اضبط طريقة الكروماتوغرافيا لتستخدم عمود C18 بطور عكسي بحجم 250 × 4.6 مليمتر بحجم جسيمات خمسة ميكرومتر. اضبط معدل التدفق إلى 1.5 ملليلتر في الدقيقة، واضبط كشف الأشعة فوق البنفسجية عند 254 نانومتر.

قم بإعداد تدرج كما هو معروض مع تغييرات مبرمجة في تركيب الطور المحمول. نقل حوالي 15 إلى 20 ملليغرام من المركب 6 إلى أنبوب رنين مغناطيسي نووي أو أنبوب الرنين المغناطيسي النووي (NMR). قم بإذابته في حجم مناسب من DMSOD6.

بمجرد تعيين معلمات الاكتساب كما هي معروضة، يمكنك الحصول على طيف الرنين المغناطيسي النووي للبروتون باستخدام تسلسل نبضات قياسي. عدل معايير الاستحواذ. ابدأ طيف البروتون والكربون بالرنين المغناطيسي النووي 13 وأبلغ عن التحولات الكيميائية بمقدار أجزاء في المليون.

تصور ومعالجة بيانات الرنين المغناطيسي النووي باستخدام ملف تحلل الحث المجاني الذي تم الحصول عليه من التجربة. لتنقية المركب 6 باستخدام الكروماتوغرافيا، قم بتعبئة عمود بجل السيليكا. حمل المركب الخامي 6 على العمود.

قم بإخراج المركب وجمع الكسور. راقب الكسور باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة وادمج الكسور التي تحتوي على المنتج النقي. أضف 100 ميكرولتر من مرق 7H9 مع إضافة 10٪ ألبومين ديكستروز كاتالاز أو ADC إلى العمود 12 من صفيحة 96 بئرا.

ثم نقل 100 ميكرولتر من مرق 7H9 يحتوي على 10٪ ADC و5٪ DMSO إلى العمود 11. ثم تدريجيا من العمود التاسع إلى واحد. أضف 200 ميكرولتر من المحلول المركب إلى العمود 10، مع تخصيص صف واحد لكل مركب.

بيبت 100 ميكرولتر من محلول المركب عند ضعف أعلى تركيز اختبار للعمود 12 من صفيحة 96 بئرا. انقل 100 ميكرولتر من العمود 10 إلى العمود التاسع وامزج جيدا عن طريق استخدام الماصات لبدء تخفيف الحبوب مرتين. استمر في التخفيف التسلسلي بالتتابع حتى العمود الأول.

أضف 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري لمتسرحية السل من العمود 11 إلى العمود الأول وغط الطبقة. أغلق اللوحة بطبقة بارا فيلم واحتضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام. بعد ذلك، أضف 60 ميكرولتر من محلول ريزازورين بنسبة 0.01٪ إلى كل بئر من اللوحة وغطها.

أغلق الصفيحة بطبقة باراغليما وحضنها على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. ثم تحقق من تغير اللون من الأزرق إلى الوردي. حضر محلول يعمل بسعة 0.5 ملليغرام لكل ملليلتر MTT في DMEM خال من المصل.

احصل على خلايا فيرو وHEPG2 المعالجة بالمركب 6 لمدة 48 ساعة وفحصها لتقييم تأثيرات العلاج. استنشق الوسط من الألواح وأضف 50 ميكرولتر من محلول MTT العامل إلى كل بئر تحت ظروف إضاءة محيطة منخفضة. بعد حضانة لمدة ثلاث ساعات، أضف 100 ميكرولتر من DMSO إلى كل بئر لإذابة بلورات الفورمازان تحت ظروف إضاءة محيطة منخفضة.

ضع اللوحة على هزاز مداري بسرعة 100 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة مع حمايتها من الضوء. افحص آبار التحكم لتأكيد الذوبان الكامل للبلورات. ضع اللوحة في قارئ ميكروبلايت.

اضبط الطول الموجي المرجعي من 630 إلى 690 نانومتر وتحقق من الامتصاص عند 570 نانومتر. حضر محلول أحمر محايد يعمل بقوة 40 ميكروغرام لكل ملليلتر في DMEM خال من المصل. ثم حضر محلول الامتصاص الأحمر المحايد الذي يحتوي على 1٪ حمض الخليك الجليدي، 49٪ إيثانول، و50٪ ماء فائق النقاء بالحجم.

بمجرد تقييم تأثير المركب 6 على خلايا فيرو وHEPG2، قم بإزالة الوسط وإضافة 100 ميكرولتر من محلول العمل المحايد المحايد المصفاة إلى كل بئر. حضن الطبق لمدة ساعتين عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد إزالة محلول العمل الأحمر المحايد، اشطف كل بئر مرة واحدة ب 150 ميكرولتر من PBS المعقم.

أضف 150 ميكرولتر من محلول الامتصاص الأحمر المحايد إلى كل بئر. ضع اللوحة على هزاز مداري بسرعة 150 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة لاستخراج الصبغة. تحقق من آبار التحكم لتأكيد استخراج الصبغة بالكامل.

اقرأ الامتصاص عند 540 نانومتر باستخدام قارئ الميكروبلايت. أظهر كروماتوجرام HPLC أن المركب 6 كان له زمن احتفاظ 14.11 دقيقة ونقاء 99٪. أظهر طيف البروتونات في الرنين المغناطيسي النووي إشارات مميزة لجزء البيبريدين بين 1.50 و3.13 جزء في المليون. واحد ميثيل بمعدل 2.38 جزء في المليون.

وإشارات عطرية تشمل الدوبليت عند 6.97 و7.17 جزء في المليون ومضاعف بين 7.63 إلى 7.75 جزء في المليون. أظهر طيف الكربون 13 NMR إشارة كربون ميثيل عند 23.81 جزء في المليون، وإشارات البايبريدين المرتبطة بين 24.85 و49.70 جزء في المليون. أظهرت لوحة MTT تدرج لوني واضح عبر تركيزات المركبات، مما يشير إلى أن السمية الخلوية كانت الأعلى عند تركيزات المركبات العالية مع الآبار الشفافة والأدنى عند التركيزات المركبة المنخفضة مع الآبار البنفسجية العميقة.

أظهرت لوحة الامتصاص الحمراء المحايدة تدرج لوني واضح عبر تركيزات المركبات، مما يشير إلى أن السمية الخلوية كانت الأعلى عند التركيزات المركبة العالية مع الآبار الشفافة وأدنى عند تركيزات المركبات المنخفضة مع الآبار الوردية الداكنة. يمثل هذا البروتوكول قناة لتطوير مرشحين أدوية ضد السل بناء على الفحص الظاهري. من المهم النظر في وتقييم انخفاض ذوبانية المركبات المصنعة أثناء تطبيق البروتوكول.

يمكن أن يكون هذا البحث أساسا للتوافر البيولوجي المستقبلي، وعدوى البلعم، والدراسات الحية.