طريقة لتكييف يوغلينا جراسيليس مع الركائز القائمة على الكسافا للزراعة غير التغذوية

يركز بحثنا على تكييف أوراق يوجلينا غراسيليس الجديدة مع نفايات الكسافا ودراسة النمو، وتقليل السيانيد، وإنتاج الكتلة الحيوية الغنية بالبروتين. يمكن تطبيق هذا البروتوكول في معالجة الكسافا المستدامة، وتمجيد النفايات الزراعية، وإنتاج الأعلاف، وأنظمة التكنولوجيا الحيوية منخفضة التكلفة. للبدء، قم بتسمية قوارير الغطاء المعقمة بسعة 500 ملليلتر المهوى مع نوع الركيزة ك garri.

حدد تركيز الهدف المناسب على القارورة. ضع علامة على القارورة التي تحتوي على التعريف المكرر وحالة التعقيم المخطط لها كمعقم أو غير معقم (معقم أو غير معقم التعميم). ضع قارب الوزن على الميزان التحليلي.

بعد الضغط على التاري، وزن الغاري ليتناسب مع حجم العمل النهائي. أضاف الغاري المثقل معقم في قارورة معقمة بسعة 500 ملليلتر تحتوي على 300 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات أو المقطر. أعد وضع غطاء التهوية على كل قارورة.

اخلط كل تعليق لمدة ثلاث دقائق حتى يتجانس الخليط. إذا تم استخدام التحريك المغناطيسي، ضع القارورة على لوحة تحريك واضبط السرعة على 200G لتشكيل دوامة ضحلة دون رذاش. دع التعليق يرطب دون إزعاج لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.

شد غطاء التهوية مباشرة قبل التخمير ولف القارورة يدويا خمس مرات لتجانس الخليط بلطف وإعادة تعليق المادة المتراكمة. لتحضير وسائط إضافية من منتجات الكسافا، قم بوضع علامة على القوارير ووزن الركيزة كما تم إثبات ذلك سابقا لتحقيق 30 جراما لكل لتر بناء على حجم العمل. قم بإضافة الركيزة المثقلة معقمة إلى قارورة معقمة تحتوي على 300 ملليلتر من الماء منزوع الأيونات أو المقطر.

أعد وضع غطاء التهوية على كل قارورة. ارطب وامزج نظام التعليق كما تم إثباته سابقا. تأكد من أن القوارير مزودة بغطاء مهوى معقم قابل للنفاذية للغاز للسماح بتبادل الغاز مع تقليل التلوث البيئي.

ضع القوارير بشكل عمودي عند درجة حرارة 25 درجة مئوية في منطقة مخصصة بعيدا عن أشعة الشمس المباشرة وتدفق الهواء عالي الحركة واحتضن القوارير دون تحريك لمدة لا تقل عن 72 ساعة. سجل تاريخ ووقت بدء التخمير لكل قارورة وحالة. تأكد من أن كل قارورة بحجم 500 ملليلتر لا تحتوي على أكثر من 300 ملليلتر من السائل بعد التخمير لمنع الغليان أثناء التعقيم.

بمجرد فك غطاء التهوية إلى وضع ضيق بالإصبع، ضع شريط مؤشر الأوتوكلاف على القارورة. بعد تحميل القوارير في صينية آمنة للأوتوكلاف، ضع الصينية في المعقم واختر دورة P13 السائلة. اضبط معايير التعقيم على 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للتعقيم السائل.

ابدأ دورة المعقم (autoclave). بعد انتهاء الدورة، دع ضغط غرفة المعقم يعود إلى الضغط الجوي وافتح باب المعقم ببطء. باستخدام قفازات مقاومة للحرارة، أزل القوارير واتركها تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.

احتفظ بالقارورة المبردة طوال الليلة في درجة حرارة الغرفة قبل التطعيم. استخدم وسط الكسافا المخمر مباشرة دون استخدام التعقيم للحفاظ على المجتمعات الميكروبية المحلية. قم بتطعيم الوسط غير المعقم فورا بعد فترة التخمير التي تستمر 72 ساعة لتقليل التلوث البيئي غير المقصود.

حافظ على التعامل المتسق عبر النسخ باستخدام نفس نوع قوارير الغطاء المهوية بسعة 500 مليلتر، ونفس حجم العمل، ونفس مدة التخمير لجميع ظروف الركيزة. قم بتلقيح يوجلينا جراسيليس في وسط غذائي طازج غير تغذوي. حضن الثقافات في ظلام تام عند درجة حرارة 28 درجة مئوية مع اهتزاز مداري مستمر عند 120G حتى تصل الثقافات إلى النمو اللوغاريتمي المتوسط.

باستخدام مجهر ضوئي مركب في وضع الحقل المضيء، افحص الزرعات بتكبير إجمالي 100 إلى 400 مرة وتأكد من الحركة النشطة، وشكل الخلايا الممدود، ومستويات الإصرار المنخفضة. استبعد الثقافات التي تظهر حطاما خلويا مفرطا، أو شكل غير طبيعي، أو إصرار مرتفع قبل تجارب التكيف. بعد توحيد الزرعات البادئ بلطف عن طريق شد غطاء التهوية، لف القوارير يدويا لمدة 15 ثانية لضمان توزيع الخلايا بشكل منتظم دون التسبب في إجهاد شديد.

باستخدام مقياس خلية الدم نيوباور، حدد كثافة الخلية. بعد خلط الثقافة عن طريق تدوير القارورة لمدة 15 ثانية، قم بإدخال ماصة واحدة من الملليلتر من الثقافة في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 ملليلتر. نظف جهاز قياس الدم وغطاء الغطاء بنسبة 70٪ إيثانول ودع جهاز قياس الدم وغطاء الغطاء ليجفا في الهواء.

قم بطباعة 10 ميكرولتر من الزراعة على الشبكتين في جهاز قياس الدم ووضع غطاء الغطاء على العينة الرطبة. باستخدام مجهر الحقل السbrightfield مع هدف 10x، ركز على الشبكة وعد الخلايا ضمن مجموعة محددة من المربعات على الشبكة الكبيرة بتطبيق قواعد الحدود القياسية. كرر عد الخلايا في الحجرة الثانية وحساب متوسط الخلايا لكل ملليلتر وكثافة الخلية.

ضبط حجم التطعيم لتحقيق لقاح نهائي بنسبة 5٪ من الحجم بحجم عبر جميع الوسائط التجريبية. تحضير لقاح منفصل لكل حالة علاجية للحفاظ على كثافة خلايا أولية ثابتة بين مجموعات التجريب. أضف حقن E. gracilis المحضر إلى وسط الكسافا المعقم وغير المعقم المحضر بتركيزات نهائية من 10 و20 و30 جراما لكل لتر.

استخدم أحجام التطعيم المتساوية عبر جميع ظروف العلاج لتوحيد كثافة الخلايا الأولية. بعد شد الغطاء المهوى، قم بتدوير القارورة بلطف في حركة دائرية لمدة 15 ثانية لتوزيع الخلايا. حضن الثقافات في ظلام تام عند درجة حرارة 25 درجة مئوية لبدء النمو غير المتجانس.

تقليل تحريك الوسط غير المعقم للحفاظ على بنية المجتمع الميكروبي الأصلي وتدرج الركيزة. اخلط جميع الزرعات مرة يوميا باستخدام تدوير يدوي لطيف لمدة 15 ثانية للحفاظ على الاتصال بين خلايا E.gracilis ومادة الكسافا المعلقة. باستخدام رأس ماصة معقمة، كل 48 ساعة، اجمع عينات بحجم ملليتر واحد من كل مزرعة بشكل معقم (معقم).

شد غطاء التهوية وحرك قارورة الزراعة بلطف لمدة 15 ثانية قبل أخذ العينة لضمان توزيع الخلايا والمواد المعلقة بشكل متساو. بعد نقل كمية من الزراعة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 ملليتر، يتم تخفيف العينة بالماء منزوع الأيونات حسب الحاجة لتحسين رؤية الخلايا الفردية. جهز شريحة مجهر رطبة عن طريق توصيل 10 ميكرولترات من العينة المخففة على شريحة مجهر نظيفة وتغطية العينة بشريحة تغطية.

باستخدام مجهر الضوء المركب في وضع الحقل الساطع، افحص العينات بتكبير إجمالي 100 إلى 400 ضعف وقيم حركة الخلية، والشكل، وتكرار الإصرار كمؤشرات على حالة التكيف. كل سبعة أيام، انقل 20٪ من الحجم بحجم لكل مزرعة بشكل معقم إلى وسط كاسافا طازج مع نفس تركيز الغاري وظروف التعقيم. حافظ على أحجام نقل ثابتة بين الممرات وتكرار مرور المراحل حتى تظهر الثقافات نموا ثابتا، وحركة مستمرة، وتكرار إصرار منخفض في وسط الكسافا بوزن 30 جراما لكل لتر.

بعد التكيف عالي التركيز مع الكسافا وتحليل النمو المقارن، استخدم شرائط القياس اللونية لتقييم مستويات السيانيد ومراقبة اللون المتطور. بعد الطرد المركزي، احصد الكتلة الحيوية لتحليلها في المراحل اللاحقة. في ظروف الزراعة المظلمة تماما، أظهرت المزارع التي تنمو بمعدل 30 جراما لكل لتر من الجاري نموا متكاملا أعلى من التركيزات الأقل.

أظهرت تركيزات الجاري المنخفضة التي تتراوح بين 10 إلى 20 جراما لكل لتر نموا ملحوظا لكنه أقل وأكثر تغيرا. وصلت تركيزات أعلى من 40 إلى 50 جراما لكل لتر إلى كثافات أعلى في الخلايا لكنها أظهرت تأخر في الاستقرار وتباين أكبر. أشارت اختبارات الاستبعاد الأزرق من Trypan إلى أن الزراعة التي تم الحفاظ عليها عند 30 جراما لكل لتر غاري حافظت على جدوى عالية عبر الفترات الزمنية المأخوذة من العينة.

أظهرت تركيزات الجاري الأعلى انخفاضات مؤقتة في قابلية الاستمرار تلتها تعافي جزئي مع زيادة التقلب مع مرور الوقت. شملت النتائج الإيجابية خلايا مستديرة أو شبه مصرة ذات حركة منخفضة وبقيت سليمة عبر الزراعة الفرعية المتكررة. أظهرت المزارع المتكيفة من E. gracilis نموا قابلا للتكرار عبر أنواع متعددة من الركائز وأظهرت استقرارا مبكرا مع انخفاض في المرحلة المتأخرة مقارنة بالمزارع البرية.

أدى التنفيذ الناجح للبروتوكول إلى إنتاج كتلة حيوية من E.gracilis تحتوي على محتوى بروتين خام قابل للقياس كما تم قياسه بواسطة التحليل المخبري الخارجي باستخدام طريقة دوماس الاحتراقية. كانت نسب البروتين التي لوحظت في الثقافات المتكيفة مماثلة لتلك التي تم قياسها في المزارع البرية ذات الإنتاج الكلي الأعلى للبروتين الذي يتوافق مع زيادة تراكم الكتلة الحيوية. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة نمو يوغلينا، وتقليل السيانيد، وإنتاج الكتلة الحيوية، والإمكانات الغذائية في بيئات مختلفة تعتمد على الكسافا.

التحدي الحاسم في هذا البروتوكول هو الحفاظ على درجة حرارة مستقرة، وظروف زراعة متسقة، ومجتمع ميكروبي متوازن لنمو يوجلينا. يمكن للدراسات المستقبلية تحسين وتوسيع نطاق هذا البروتوكول، وتحسين إنتاج البروتين، واختبار تطبيقات صناعية مختلفة باستخدام تدفقات نفايات الكسافا المتنوعة على نطاق واسع.