تقييم تأثير المرشحات والمرشحات المسبقة على عدوى وتركيز فيروس Phi6 المنبعث من الجذاذ

نبحث في تأثير المرشحات المسبقة والطلاءات المضادة للفيروسات في تقليل عدوى الفيروسات المحمولة جوا وتركيزاتها في الأماكن المغلقة. الطرق الحالية تغفل عن ديناميكيات تدفق الهواء الواقعية. بروتوكولنا يعيد خلق حالات الهباء الجوي ويقيس كل من الفيروسات المعدية والحمل الإجمالي للفيروسات.

للبدء، قم بتخفيف تعليق مخزون البكتيريوفاج البتكتيري النقي من نوع phi6 في محلول فوسفات بوتاسيوم بطول 20 ميلي مول يحتوي على كلوريد المغنيسيوم المغنيسيوم المعادل إلى درجة حموضة 7.2. قم بتجميع جميع مواد الفلتر، والفلتر المسبق، ومواد الطلاء المضادة للفيروسات داخل خزانة السلامة الحيوية لإجراء اختبارات السطح. تقييم النشاط المضاد للفيروسات لجميع مواد الطلاء المبنية على النحاس أو المكونات النشطة من النحاس والفضة المدمجة في مصفوفات خاصة، وهي A6، B4، VS وVS B على قطع اختبار مسطحة.

بعد ذلك، قم بعمل ماصة بحجم 20 ميكرولتر من محلول مخفف من مخزون بكتيريوفاج فاي 6 على قطع اختبار مطلية لإجراء اختبار قابلية السطح. وزع العينة بشكل متساو على مساحة 2 في سنتيمترين باستخدام مثلث زجاجي معقم. حضن العينات عند 22 درجة مئوية حتى أربع نقاط زمنية، منها دقيقة واحدة، خمس دقائق، ساعة واحدة، أو ثلاث ساعات.

أضف 180 ميكرولتر من مرق LB الطازج إلى السطح لاستعادة الفيروسات بعد كل نقطة زمنية. اغسل السطح بتكرار الأنابيب 10 إلى 20 مرة لجمع العينة. استخدم طبق بتري بلاستيك كسطح تحكم.

قم بقياس فعالية مضادات الفيروسات لطلاءات السطح باستخدام اختبار البلاك لقياس عدد الجسيمات الفيروسية المعدية وتفاعل التسلسل الكمي العكسي لإنزيم البوليميراز (qRT-PCR)، لتحديد أعداد نسخ الجينوم الفيروسية. تخفيف تعليق البكتيريوفاج المعالج النقي والمركز كما تم إثباته سابقا للحصول على تركيز فيروسي يتراوح بين 2.5 مضروبا في 10 إلى قوة 10، إلى 4.08 في 10 في قوة 11 وحدة مكونة للبلاك لكل ملليلتر. بعد ذلك، قم بتجميع غرفة الهباء الجوي التجريبي باستخدام جسم زجاجي أسطواني مع غطاء مطابق.

أدخل السقالة المعدنية الداخلية في الحجرة وثبت الحشوات العازلة لضمان إغلاق محكم الهواء. استخدم جهاز التنشاخ مع مضخة هواء لتوليد مدخل مستقر وقابل للتكرار من الهباء الجوي الفيروسي. قم بتعديل محلول الفيروس المستخدم في جهاز التنشئة قبل وبعد كل تجربة لمراقبة الاستقرار.

اضبط معدل تدفق الهباء الجوي إلى ثمانية لترات في الدقيقة داخل الحجرة. لتقليل الرطوبة أثناء القياسات المطولة، توجه حوالي ثلاثة أرباع تدفق الهباء الجوي إلى العادم عبر فلتر هوائي عالي الكفاءة، أو HEPA. يسمح للربع المتبقي من التدفق المقابل لترين في الدقيقة بالدخول إلى الحجرة.

استخدم قمع لتوجيه تدفق الهباء الجوي نحو المرشح أو سطح المرشح المسبق داخل الحجرة. قم بإزالة الرطوبة من تدفق الهواء الخارج باستخدام مجفف لحماية فلتر HEPA ومقياس التدفق من الرطوبة الزائدة. باستخدام المضخة الخارجية، يخلق ضغطا سلبيا داخل النظام، ويدعم تدفق الهواء لضمان كفاءة العادم عبر منفذ المخرج.

قيم خصائص مضادة الفيروسات لمرشحات بوليستر وبولبرين غير المطلية أو المطلية ب VS مع بولبرين إلى جانب مواد ألياف زجاجية مزدوجة الطبقات داخل غرفة الهباء الجوي. لتقييم التأثير المضاد للفيروسات من خلال أخذ عينات الانسداد، ضع طبق بتري يحتوي على مخزن HEPES بوزن 20 مليمولر عند pH 7.2 مباشرة تحت مرشح الاختبار المسبق لتعظيم ترسيب الجسيمات. بدلا من ذلك، لاختبار التأثير المضاد للفيروسات لمرشحات GF2، قم بتركيب مقبض دوامي زجاجي بالكامل بثلاثة فوهات متصل بمضخة خارجية لجمع الهباء الجوي.

حافظ على تدفق الهواء عبر فلتر أو فلتر الاختبار عند لترين في الدقيقة. زد تدفق الهواء الكلي إلى 10 لترات في الدقيقة باستخدام صمام إضافي بعد مخرج الحجرة. التقاط الهباء الجوي في خمسة ملليلتر من مخزن HEPES بقطر 20 ملليمول.

وجدد المخزن المبخر كل 30 دقيقة. لأخذ عينات ثلاثية، قم بإجراء عمليات تحكم بدون مرشحات أو فلاتر مسبقة لمدة 15 دقيقة قبل وبعد كل تجربة. بعد تشغيل التحكم قبل التجربة، أدخل الفلتر أو المرشح المسبق في الحجرة وشغل النظام لمدة ثلاث ساعات.

اجمع الهواء الجوي الفيروسي عن طريق استرجاع ملليتر واحد من التعليق من أطباق بتري تحتوي على 20 ملليلتر من المحلول كل 30 دقيقة. قم بإزالة الفلتر وإجراء عملية تحكم بعد التجربة. جمع عينات كل 30 دقيقة خلال التجربة للحصول على ثماني عينات qRT-PCR ومعيارية لكل تجربة لكل تجربة.

في تجارب التصادم، اجمع عينات المعايرة مرة واحدة فقط في نهاية فترة الثلاث ساعات. استخدم 800 ميكرولتر من العينة المجمعة لتحليل qRT-PCR و200 ميكرولتر المتبقية لمعايرة الفيروس. قم بتجميد عينات qRT-PCR في النيتروجين السائل وتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية.

عالج عينات معايرة الفيروس فورا باستخدام اختبار البلاك. أظهرت اختبارات قابلية السطح أن جميع الطلاءات التي تم اختبارها أعادت تعطيل الفيروس بنجاح مع ملاحظة انخفاضات كبيرة خلال أول خمس دقائق. حقق الطلاء السطحي القائم على النحاس، B4، أسرع خفيض، حيث قلل عدد العدوى بمقدار ثلاثة مرتبة خلال خمس دقائق، ووصل إلى حالة إيقاف كاملة مع حد كشف أقل من 100 وحدة لتكوين اللويحات لكل مليلتر بمقدار 15 دقيقة.

حقق طلاء A6 تعطيل الفيروس بالكامل خلال 25 دقيقة، وVS B خلال 60 دقيقة. أظهر طلاء VS أبطأ معدل تعطيل بين المواد المختبرة. كانت المرشحات المسبقة المدروسة BP6 وS11 وFMR5 فعالة بنفس القدر في تقليل عدد الفيروسات المعدية، حيث تمر من خلالها بمقدار 1.5 إلى 2 مرتبة مقارنة بالتحكم بدون مرشح.

أظهرت مرشحات GF2 أداء متفوقا، حيث خفضت الحمل الفيروسي بمقدار لا يقل عن ستة مرتبة حجم، ولم يتم اكتشاف أي لويحات عدوى لفيروس phi6 ضمن حد الكشف. لم يؤثر طلاء VS B بشكل كبير على فعالية ترشيح الفيروسات المعدية مقارنة بالمرشحات المسبقة غير المطلية. أظهرت نتائج qRT-PCR أن المرشحات المسبقة خفضت أعداد نسخ الجينوم الفيروسي بما يصل إلى مرتين من الحجم.

أظهر مرشح GF2 انخفاضا يصل إلى أربعة مرتبة من الدرجة مقارنة بالتحكم بدون مرشح. بينما بقيت الفروقات بين المرشحات المسبقة والتحكم ضئيلة خلال أول 30 دقيقة، زادت كفاءة الترشيح الميكانيكي مقارنة بنقطة ال 60 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، لم يكن لتطبيق طلاء VS B تأثير قابل للقياس على عدد الجينومات الفيروسية التي تمر عبر وسط الترشيح.

يتيح هذا البروتوكول للباحثين قياس تعطيل الفيروس، وكفاءة الترشيح، والفروق بين الجسيمات المعدية والحمل الكلي للفيروس. التحدي الرئيسي هو قصر وقت تلامس سطح الفيروس أثناء تدفق الهواء، مما يحد من فعالية الطلاءات المضادة للفيروسات. يمكن للدراسات المستقبلية أن تستكشف دمج الطلاءات مع الأشعة فوق البنفسجية أو اختبار الأداء في أنظمة التهوية الواقعية ومع فيروسات متنوعة.