الوسم الفلوري الداخلي المعتمد على CRISPR/Cas9 لجينات محددة في التهاب الكاينورهابديتس المهاجر

نستخدم الوسم الداخلي المعتمد على كريسبر لدراسة تحديد موقع وديناميكية بروتينات الخط الجرثومي في C.elegans. قد تؤثر الجينات المعدلة التقليدية على التعبير في الخط الجرثوي، لكن هذا البروتوكول يضع علامات على البروتينات في الموقع الداخلي تحت السيطرة الطبيعية. للبدء، حدد الجينات المرشحة ذات التعبير السائد في الغدد التناسلية أو الخلايا الجرثومية باستخدام قواعد بيانات عامة وأدبيات منشورة.

بعد فتح مدخل UniProt للبروتين المستهدف، انقر على الهيكل لتقييم الميزات الهيكلية ومجالات البروتين وتحديد موقع وسم فلوري مناسب. قم بالتمرير للأسفل وافتح مدخل قاعدة بيانات ألفا فولد للتحقق من قيم ثقة النموذج. انقر على النطاقات للاطلاع على تصنيفات هيكلية محددة.

بعد ذلك، افتح صفحة الجين المستهدف في WormBase. انزل للأسفل وانقر على أداة التسلسلات، ورابط النص الأساسي لفتح صفحة النص. انزل إلى قسم التسلسلات وانقر على الخيار المحدد لكشف التسلسل المدمج للنص المختار.

في صفحة أداة تصميم RNA دليل IDT CRISPA-Cas9، انسخ والصق أول تسلسل إكسون للجين المستهدف من صفحة WormBase، واختر C، elegans من قائمة الأنواع المنسدلة لتصميم RNA أو gRNA الإرشادي. انقر على زر التصميم للحصول على أعلى تسلسل gRNA الموصى به وتسلسل PAM المقابل له. على SnapGene، اختر Sequence لتحديد نقطة الاستنساخ بين محفز CeU6 ومنطقة سقالة gRNA.

انسخ تسلسل gRNA من صفحة أداة IDT، والصقه في مربع حوار الإدراج، ثم اضغط على إدراج لدمج الفاصل في البلازميد الخاص بتعبير كريسبر. لتأكيد دقة إدخال gRNA، اختر التسلسل وانقر على عرض المحاذاة لمقارنة نتيجة تسلسل سانجر قاعدة بقاعدة مع التسلسل المتوقع. لبناء بلازميد المتبرع، قم بنسخ التسلسلات الجينومية لذراع التجانس من WormBase.

في SnapGene، قم بلصق التسلسل واضغط على إدراج. بعد ذلك، انقر بزر الفأرة الأيمن على موقع الإدراج لفتح نافذة Set DNA Color وغيرها إلى برتقالي لتحديد نقطة التصل. انسخ تسلسل البروتين الفلوري الأخضر أو إدخال GFP ولصقه مباشرة في الموضع المحدد.

ثم اضغط على إضافة ميزة. سم ميزة GFP. غير لون العرض إلى الأخضر واضغط موافق لإكمال تجميع بلازميد المانح داخل السيليكو.

لإدخال استبدال صامت في قالب البلازميد المانح لمنع إعادة قطع Cas9 بعد التكامل، انسخ فاصل gRNA ذو 19 نوكليوتيد من متجه التعبير. في تبويب البلازميد المتبرع، قم بلصق التسلسل في شريط البحث عن تسلسل الحمض النووي لتحديد الموقع المستهدف وتحديد الموقع المحدد للنوكليوتيدات للتحول. في استبدال القاعدة، أدخل نيوكليوتيدات جديدة واضغط على إدراج.

انقر بزر الفأرة الأيمن على القاعدة المعدلة واستخدم Set DNA Color لتغيير لونه إلى الأحمر. قم بمحاذاة نتائج تسلسل بلازميد سانجر المتبرع بالتسلسل المتوقع للتأكد من سلامتها. جهز خليط الحقن بدمج بلازميد تعبير كريسبر، وبلازميد المتبرع، وعلامات الحقن المشتركة في ماء مقطر مزدوج معقم إلى حجم نهائي يبلغ 10 ميكرولتر عند التركيز المعروض.

ثم قم بطرد المركزي بالخليط عند 10,000 جرام لمدة 10 إلى 20 دقيقة لطرد الجسيمات ومنع انسداد الشعيرات الدموية الدقيقة للحقن. استخدم أداة سحب الإبر لصنع إبر حقن دقيقة من شعيرات زجاجية ذات تدرج طويل ورأس حاد مناسب لحقن الغدد التناسلية، مع تحسين الإعدادات القطبية تجريبيا. سخن ماصة شعيرات دقيقة وقم بتقطيعها إلى قطعتين لإنشاء أداة تحميل.

قم بتثبيت لمبة شفط مطاطية على الطرف العريض من الماصة الدقيقة القصيرة الشعرية. استنشق حوالي ميكرولتر واحد من خليط الحقن داخل المحمل. أدخل الجرافة في الجزء الخلفي من إبرة الحقن وقم بتفريغ خليط الحقن بلطف.

ضع الإبرة المحملة أفقيا لمدة 10 دقائق لتشكيل عمود مستمر والسماح للمحلول بالاستقرار نحو الطرف. قم بتركيب الإبرة على مجهر الحقن وجعل الطرف في التركيز باستخدام عدسات المجال الساطع. افتح طرف الإبرة بلمسة لطيفة مع حافة غطاء الغطاء في زيت هالوكربون وتحقق من تدفق الإبرة.

لزراعة الديدان للحقن، حافظ على ديدان النوع البري N2 على ألواح وسائط بذرة بكتيريا OP50. اختر الخنثى في مرحلة L4 من صفيحة صحية وحضن عند 20 درجة مئوية لمدة 10 ساعات للحصول على شباب بالغين ذوي خطوط جرثوفية متطورة. انقل الديدان إلى صفيحة غير مزروعة لتقليل انتقال البكتيريا.

حضر وسادة جافة بحجم 2٪ أغاروز على شريحة زجاجية. ووضع قطرة من زيت الهالوكربون. استخدم أداة التقاط الرموش لنقل دودة إلى وسادة الأغاروز وتثبيتها.

استخدم هدفا منخفض التكبير لتوجيه الغدد التناسلية أثناء الحقن. استخدم أدوات التحكم الدقيقة لوضع الإبرة بزاوية تتراوح بين 20 إلى 40 درجة بالنسبة للدودة. استخدم التكبير العالي للتركيز على الخط الجرثومي البعيد.

تقدم الدودة إلى الإبرة ووضع طرفها داخل الخلل التناسلي التناسلية. حقن المحلول حتى تنتفخ الغدد التناسلية. اسحب الإبرة وأعيد وضعه للحقن لاحقا.

أضف حاجز M9 لتليين وتفكيك وسادة الأغاروز جزئيا لإطلاق الديدان. انقل كل دودة إلى صفيحة تعافي فردية. ثم كرر الحقن ل 20 إلى 25 دودة.

افحص نسل F1 لعلامات الحقن المشتركة واختيار الحيوانات الموجبة للعلامات. انقل كل دودة F1 إلى طبق منفصل واترك لمدة يوم إلى يومين لوضع البيض. قم بتحليل كل دودة F1 في مخزن K البروتيناز لتحضير قوالب PCR.

قم بإجراء PCR الوصلة باستخدام تمهيد جينومي واحد خارج ذراع التجانس ومبرايمر وسم داخلي واحد. وتحتفظ بألواح مقابلة من حيوانات F1 إيجابية PCR. عزل نسل F2 من خطوط F1 الموجبة PCR على صفائح فردية لإنتاج ذرية.

البالغون في Lyse لتحديد الجينات. قم بإجراء PCR باستخدام بادئات جانبية لأذرع التجانس لتمييز الأليلات البرية والأليلات القابلة للدخول حسب حجم المنتج. استخدم أداة SnapGene للتحقق من التكامل الصحيح والتحقق من التكامل الصحيح عند كل من وصلتي الإدخال الأيسر والأيمن عن طريق محاذاة نتائج تسلسل سانجر مع التسلسل الجينومي المعدلة المتوقع.

استخدم المجهر الفلوري للتحقق من تعبير الخط الجرثوي وتحديد موقعه. توسيع الخطوط المتجانسة المؤكدة. الحفاظ على المخزونات وخطوط الحفظ المجد للتخزين طويل الأمد.

كشف الفحص المعتمد على PCR لنسل F1 عن نجاح في الإدخال بواسطة 1,550 زوج قاعدي من وصلات PCR باستخدام مبرايمر جينومي جانبي وواحد داخلي GFP. غياب نطاق 1,550 زوج قاعدة في معظم حيوانات F1 أشار إلى عدم وجود تكامل هدف قابل للكشف، مما يتوافق مع نقل الحمض النووي غير التكاملي وليس الإصلاح الموجه بالتماثل. تحديد الزيجوسية في نسل F2 المستمد من خطوط PCR الإيجابية للتقاطع يميز الأليلات حسب حجم النطاق عند 1,345 زوج قاعدي كأليل من النوع البري، و2,344 زوجا قاعديا كأليل مدخل.

تظهر الهيتروزيجوت كلا الفرقتين. العينات المتجانسة التي تدمج الداخل تفتقر إلى نطاق حجم النوع البري، والعينات التي فشل فيها التكامل تظهر فقط المنتج بحجم النوع البري. تم إجراء تأكيد إضافي لخط الضربة المتماثل الزigigous ل GFP باستخدام التصوير المجهري الكونفوكلي، حيث لوحظ تألق GFP في خلايا الجرثومة ذات الإشارة الغنية في المنطقة المسببة للحيوانات المنوية.

يتيح هذا البروتوكول التحليل الحي لتحديد مواقع البروتين وديناميكيات في خط جرثوتي C.elegans. تصميم الوسم الدقيق والتحقق الدقيق ضروريان للحفاظ على وظيفة البروتين وتقليل المرشحين الإيجابيين الكاذبين. يمكن للدراسات المستقبلية استخدام هذا السير لتتبع توطين البروتينات واستكشاف التفاعلات المحتملة أثناء تطور الخط الجرثوي.