بروتوكول مبسط لمجهر تحديد موقع جزيء واحد في نوى الأرابيدوبسيس
مايو 8, 2026
يقدم هذا البروتوكول سير عمل فعال لتصوير المجهر لتحديد موقع جزيء واحد لنوى الأرابيدوبسيس المعزولة، باستخدام العزل والتثبيت ووضع العلامات المحسنة لتحقيق تصور موثوق على نطاق نانوي للكروماتين وبوليميراز RNA II. يمكن تكييف هذا النهج بسهولة مع بروتينات أخرى مرتبطة بالكروماتين أو تعديلات الهيستونات للتصوير عالي الدقة.
يركز بحثي على تحرير الجينوم وتصور تنظيم الكروماتين في نوى الأرابيدوبسيس باستخدام المجهر فائق الدقة. الطرق الحالية غير متكيفة مع تصوير العاصفة. يحسن هذا البروتوكول نقاء النوى، واتساق الوسم، وتركيب العينات، واستقرار التصوير.
ينطبق على الأرابيدوبسيس ثاليانا وأنظمة النباتات الأخرى لدراسة التنظيم النووي، وبنية الكروماتين، وعلم التخلق فوق الجيني بدقة عالية. للبدء، ضع طبق زراعة بستة آبار على الثلج تحت غطاء البخار. اخلط محلول التثبيت الذي يحتوي على 4٪ حجم بالحجم، والفورمالديهايد المثبت بالميثانول 0.1٪ ترايتون X100 وPBS.
أضف حوالي أربعة ملليلتر من محلول التثبيت البارد المثلج إلى كل بئر تحت غطاء البخار. باستخدام ملقط نظيف، قم بإزالة شتلات الأرابيدوبسيس التي تتراوح بين ثمانية وخمسة عشر يوما بعد الإنبات من موراشيغي وسكوغ الصلب نصف القوة، أو وسط MS. اغمر الشتلات فورا في محلول التثبيت وضع حوالي 20 شتلة في كل بئر.
استخدم ثلاثة آبار للحصول على كمية كافية من المواد لكل عينة. ضع اللوحة في غرفة التفريغ المملوءة بالثلج وأغلقها. طبق تفريغ كهربائي يتنقل بين ناقص 0.6 بار و0.8 بار لمدة 15 دقيقة لإزالة الهواء المحبوس والسماح باختراق عميق للمثبت في أنسجة النبات.
ثم، حرر المكنسة تدريجيا. اخلط العينة وطبق المكنسة الكهربائية لمدة 15 دقيقة إضافية. تحت غطاء البخار، أزل محلول التثبيت باستخدام ماصة.
اغسل كل بئر ثلاث مرات لمدة 10 دقائق مع تحريك خفيف باستخدام خمسة ملليلتر من PBS البارد مثلج. بعد الغسل، أزل PBS. باستخدام الملقط، انقل النسيج الثابت إلى طبق بتري بقياس 120 × 120 ملم وأضف 50 ميكرولتر من حاجز عزل النوى إلى الشتلات الثابتة.
باستخدام شفرة، قطع النسيج الثابت. باستخدام نفس النصل، كشط المنديل المقطع إلى طرف واحد من طبق بيتري. أضف 600 ميكرولتر من حاجز عزل النوى واغسل أي نسيج ملتصق بالشفرة.
انقل خليط الأنسجة إلى أنبوب متجانس Dounce بسعة ملليتر وقم بتمرير المدقة الصغيرة من خمس إلى عشر مرات. ثم يلمس المدقة الأكبر حتى يتحرك بسلاسة داخل الأنبوب، وعادة ما يتطلب الأمر من خمس إلى عشر ضربات. قم بترشيح العينة المتجانسة عبر فلتر شبكي بحجم 30 ميكرومتر إلى أنبوب بسعة 50 ملليمتر.
انقل الفلترة إلى أنبوب جديد بسعة 1.5 ملليتر. قم بعمل نظام التعليق المركزي لمدة 10 دقائق عند 800G باستخدام أدنى منحدر لكل من التسارع والتباطؤ. بعد الطرد المركزي، لاحظ أن هناك كرة بيضاء صغيرة تظهر بين حطام الأنسجة الخضراء.
تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات في 600 ميكرولتر من مخزن عزل النوى. استخدم الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 10 دقائق عند 800 جرام وأخرج السوبرناتان. بعد غسل الحطام الأخضر بالكامل، خزن تعليق النوى المعزولة عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة أسبوع كحد أقصى، ثم قم بتلطيع النوى بالأجسام المضادة المطلوبة.
سخن محلول الأغاروز منخفض الذوبان بنسبة 1.5٪ من الوزن حسب الحجم على درجة حرارة 90 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة لإذابة المسحوق والحصول على محلول شفاف. Vortex لفترة وجيزة لضمان المزج الكامل. قم بتبريد المحلول والحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية قبل الاستمرار لتجنب إزالة الرطوبة الحرارية في محلول أكسيداز الجلوكوز.
بعد أن يصل محلول الأغاروز منخفض الذوبان إلى 37 درجة مئوية، جهز مخزن STORM بإضافة 100 ملي مول ميركابتوإيثيل أمين ومخمل جلوكوز أكسيداز إلى الأغاروز منخفض الانصهار لتحقيق تركيز نهائي 1x وامزج المحلول بلطف. وضع 10 ميكرولترات من خليط النوى على غطاء معالج بالأوزون بسعة 1.5H تم معالجته لمدة 20 دقيقة في نظام تنظيف الأوزون بالأشعة فوق البنفسجية. انتظر ثلاث دقائق حتى تسمح للنوى بالترسب على ورقة الغلاف.
ثم أزل السائل الزائد وانتظر دقيقتين. أضف 10 ميكرولترات من الأجاروز المحضر منخفض الذوبان إلى شريحة الغطاء وغطها فورا بشريحة المجهر. أغلق غطاء الغطاء باستخدام مادة سلب سيليكون.
اخلط كميات متساوية من المحلول A والمحلول B في طبق بتري صغير باستخدام رأس ميكروبايبت. ضع الخليط على حواف انزلاق الغطاء لإغلاق العينة. دع مادة السيليكون لتتصلب لمدة خمس دقائق.
ثبت شريحة العينة على المجهر وابحث عن التركيز. حدد مركز وتركيز عليه. فعل وحدة للحفاظ على التركيز إذا كانت متاحة لضمان الاستقرار أثناء عمليات الاستحواذ الطويلة.
اختر منطقة يتم فيها وضع واحد أو عدد قليل من النانودايموند بالقرب من النواة لتحسين تصحيح الانحرافات أثناء إعادة البناء. للتصوير بلونين، ابدأ بالاكتساب باستخدام قناة الطول الموجي الأطول ثم انتقل إلى قناة الطول الموجي الأقصر لإكمال التصوير. معالجة أكوام الصور الخام في ThunderSTORM باستخدام تركيب Gaussian مع تقدير المربعات الصغرى الموزونة وتوليد صور معاد بناؤها.
تطبيق التصفية بناء على السيغما وعدم اليقين تحت 30 نانومتر للحفاظ على تحديد المواقع بدقة وإزالة الضوضاء. وأخيرا، قم بتصحيح انحراف العينة باستخدام الارتباط المتقاطع ThunderSTORM أو خوارزمية COMET وتأكيد الانجراف الأدنى في الصور المعاد بناؤها. تم عزل النوى من شتلات برية عمرها 15 يوما ومصنفة مناعة بأجسام مضادة ثانوية متقاربة من AF647 وصبغت ب Hoechst H33258.
أظهر التصوير الكونفوكي عدة نوى معزولة ومحفوظة جيدا مع حطام طفيف مع مراكز كرومومركزية ونواة يمكن تمييزها بوضوح. كانت إشارة بوليميراز RNA II غائبة عن الكروموسنترات والنواة. حدت الإسقاطات القصوى للحدة والحيود، وكشفت إعادة بناء SMLM المقابلة عن تفاصيل هيكلية لبوليميراز RNA II وتصنيف DNA، بما في ذلك مناطق موسعة أظهرت هياكل أدق.
حسن التصفية الموضعية بناء على السيغما وعدم اليقين تعريف كل من إشارات بوليميراز RNA II وDNA مقارنة بالتوطين المكتشف. واستمر المزيد من التحسين بعد تصحيح الانجراف في الحفاظ على هذا الهيكل المحسن. التصفية بناء على قيم سيغما أزالت التموضعات ذات العرض الصغير أو الكبير جدا المتوافق.
أظهر تحليل الارتباط الحلقي بفورييه أن الدقة في قناة AF647 تحسنت من 90.1 إلى 47.7 نانومتر بعد الترشيح، بينما تحسنت قناة JF549 من 56.6 إلى 27.9 نانومتر. الحفاظ على السلامة النووية مع تقليل الحطام والفلورة الخلفية أمر حاسم لتحقيق تصوير جزيء واحد عالي الجودة. يمكن للدراسات المستقبلية ربط البنية النووية بتنظيم الجينات في الظروف البيئية أو التنمائية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
Overview
This article introduces a streamlined and reproducible protocol for Single-Molecule Localization Microscopy (SMLM), specifically direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), to visualize chromatin architecture in nuclei isolated from Arabidopsis thaliana. The workflow addresses technical challenges in plant sample preparation, enabling nanoscale imaging of chromatin domains, histone modifications, and nuclear organization with enhanced clarity and reproducibility.
Key Study Components
Area of Science
- Plant cell biology
- Super-resolution microscopy
- Chromatin organization
Background
- Confocal fluorescence microscopy is limited by diffraction, restricting resolution in chromatin studies.
- Super-resolution techniques like SMLM overcome these limitations, providing nanoscale insights.
- dSTORM is widely used in mammalian systems but less so in plants due to sample preparation challenges.
- Improved protocols are needed to facilitate SMLM in plant nuclei.
Purpose of Study
- To develop a reproducible workflow for SMLM imaging of plant nuclei.
- To enable high-resolution visualization of chromatin modifications and nuclear architecture in Arabidopsis thaliana.
- To lower technical barriers for applying super-resolution microscopy in plant biology.
Methods Used
- Fixation of Arabidopsis seedlings to preserve nuclear morphology.
- Gentle tissue chopping and centrifugation to enrich for intact nuclei.
- Fluorophore labeling of isolated nuclei in liquid medium.
- Immobilization of nuclei on low-melting agarose pads for imaging stability.
Main Results
- The protocol minimizes background fluorescence and improves labeling consistency.
- Enhanced reproducibility is achieved across biological replicates.
- Preparations allow clear visualization of chromatin modifications and nuclear architecture at the nanoscale.
- The workflow facilitates studies of epigenetic regulation and nuclear topology in plants.
Conclusions
- This protocol establishes a methodological foundation for SMLM imaging in plant systems.
- It bridges the gap between plant and mammalian cell biology in super-resolution imaging.
- The approach opens new opportunities to study genome regulation and nuclear architecture in response to developmental and environmental cues in plants.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Super-resolution imaging of chromatin architecture in plant nuclei addresses a critical gap in understanding epigenetic regulation and nuclear organization at the nanoscale. This streamlined SMLM protocol for Arabidopsis nuclei enables reproducible, high-resolution visualization, supporting predictive confidence in chromatin state analysis. The approach enhances early discovery and mechanistic de-risking for plant-based R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables nanoscale interrogation of chromatin domains and histone modifications in plant nuclei.
- Supports functional validation of epigenetic targets by visualizing nuclear architecture changes.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct observation of chromatin organization.
- Improves predictive confidence in linking nuclear structure to gene regulation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized sample preparation for reproducible super-resolution imaging workflows.
- Delivers quantitative, high-clarity readouts of chromatin modifications for assay development.
- Enables consistent labeling and imaging across biological replicates, supporting screening scalability.
- Prepares validated plant nuclear systems for downstream compound or genetic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns chromatin imaging outputs with translational biomarker discovery in plant systems.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of epigenetic interventions.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying nuclear topological changes under different conditions.
- Provides mechanistic insights relevant to environmental and developmental response studies.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early chromatin hypothesis testing to preclinical validation of epigenetic mechanisms in plants.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of chromatin organization and nuclear architecture.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for assay standardization.
- Analytics: Enables precise measurement of chromatin modifications and nuclear features for comparative studies.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by enabling biomarker alignment in plant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging workflow adaptable to diverse plant research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in chromatin state analysis.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and imaging, enhancing reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for epigenetic target programs in plant R&D.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of plant-based discovery and translational projects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in super-resolution microscopy and plant nuclear isolation.
- Needs access to dSTORM-capable imaging platforms and fluorophore labeling reagents.
- Demands cross-team standardization of fixation, labeling, and immobilization protocols.
- May require adaptation for different plant species or tissue types.
- Sample stability and background minimization are critical for reproducible outputs.
