عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من عضلة الهياكل العظمية في الفأر ونخاع العظم بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم
يونيو 23, 2026
يصف هذا البروتوكول عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية من عضلات الهيكل العظمي والنخاع العظمي للفئران باستخدام الهضم الإنزيمي والكروماتوغرافيا بإزالة الحجم، مما يتيح استعادة الكسور الغنية بالحويصلات من أنسجة بنية معقدة منخفضة الإنتاج لتحليل جزيئي لاحق.
تركز أبحاثنا على عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن عضلات الفئران ونخاع العظم لفهم كيفية تبادل الأنسجة للإشارات. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الدراسات المتعلقة بالشيخوخة، وتجديد العضلات، وفسيولوجيا التمارين، والدراسات الفيزيولوجية المرضية لنخاع العظم في نماذج الفئران. للبدء، ضع عينات الفخذ والساق والفأر في خزانة أمان بيولوجي.
قم بوزن أنابيب الطرد المركزي بحجم 1.5 ملليتر مسبقا ووضع علامة عليه. بعد ذلك، ثقب أسفل أنبوب بسعة 0.2 ملليلتر باستخدام إبرة معقمة عيار 16 مقيدة مثبتة عموديا على القاعدة، مما ينتج فتحة واحدة موحدة. أدخل الأنبوب المثقوب في أنبوب الطرد المركزي بوزن 1.5 ملليلتر مع تركيب محكم لتحضير إعداد الأنبوب المثقوب.
ضع عظام الساقين في طبق بترى معقم. افصل عظم الفخذ عن عظم الساق عن طريق قطع المسافة المفصلية. اقطع طرفي عظم الفخذ والساق لكشف النخاع الأحمر.
ضع العظام في أنبوب PCR المثقوب، الموضوع داخل أنبوب 1.5 ملليلتر، وأغلق التجميع باستخدام باراغليم. قم بعمل الطرد المركزي للعينة لمدة 10 ثوان في جهاز طرد مركزي على طاولة عند حوالي 8,000 جرام في درجة حرارة الغرفة. تحقق من نجاح استخراج النخاع من خلال وجود عظام بيضاء واضحة، خالية من النخاع الأحمر المتبقي في الأنبوب العلوي، والحبيبات الحمراء الداكنة والمضغوطة في أسفل الأنبوب السفلي.
ثم قم بوزن أنبوب 1.5 ملليلتر مرة أخرى لتحديد كتلة النخاع المستخرج لضمان أنه يقع ضمن النطاق المتوقع حوالي 15 إلى 30 ملليغرام لكل فأر. أضف 250 ميكرولتر من RPMI 1640 إلى كل أنبوب يحتوي على نخاع العظم وضع العينات على الثلج. أعد تعليق النخاع عن طريق التوصيل بلطف للأعلى والأسفل من 10 إلى 15 مرة باستخدام ماصة P1000 حتى يتم الحصول على تعليق متجانس دون تبقية كتل أو شظايا نسيج سليمة.
قم بطرد العينة على حرارة 300 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة الحطام غير المهضوم، والخلايا السليمة، وقطع الأنسجة المتبقية. انقل المادة الفائقة بحذر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 ملليلتر دون الإزعاج بالرصاصة. قم بالطرد المركزي بدفع المادة الفائقة المنقولة على 2,000 جرام لمدة 15 دقيقة لإزالة الحطام الكبير.
اجمع المادة الفائقة في أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي جديد مرة أخرى عند 10,000 جرام لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. ثم اجمع على الأقل 200 ميكرولتر من المادة الفائقة النهائية في أنبوب جديد. توازن عمود كروماتوغرافيا استبعاد الحجم عن طريق تنظيفه بستة ملليتر من PBS المفلتر، مع الحفاظ على العمود وPBS عند درجة حرارة الغرفة.
اسمح للحجم الكامل أن يمر عبر العمود بالجاذبية. ثم تحميل 150 ميكرولتر من المادة الفائقة المفلترة على العمود والسماح للعينة بالدخول إلى الراتنج بالكامل. تصل النقطة النهائية عندما يصل الغضروف الهلالي السائل إلى سطح طبقة الراتنج دون أن يبقى سائل مرئي فوق الراتنج الرطب.
أضف فورا 550 ميكرولتر من PBS لبدء الغسل وجمع حجم الفراغ البالغ 700 ميكرولتر. تخلص من حجم الفراغ أو احتفظ به كجزء من الحويصلات خارج الخلية. ابدأ بجمع الجزء الغني بالحويصلة خارج الخلية فور انتهاء حجم الفراغ البالغ 700 ميكرولتر.
تأكد من جمع 850 ميكرولتر من النسيج المغني بالحويصلة خارج الخلية. لتركيز الحويصلة خارج الخلية، يتم تحميل العينة في مرشح طرد مركزي مغطى مسبقا مع حسم وزن جزيئي يبلغ 100 كيلو دالتون. قم بطرد العينة على حرارة 4,000 جرام عند أربع درجات مئوية، مع الفحص كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى الوصول إلى الحجم النهائي المطلوب.
ثم استرجع الريتنات عن طريق التوصيل اللطيف بالماصة. احتفظ بالأجزاء الغنية بحويصيرية خارج الخلية على الجليد لإجراء الفحوصات الفورية، مثل المجهر الإلكتروني الناقل. أظهر تحليل البقعة الغربية وجود حويصلات صغيرة خارج الخلية، أو علامات SEV في الكسور المبكرة.
تم تجميع الأجزاء من واحد إلى خمسة لتوصيف الحويصلات الصغيرة خارج الخلية لاحقا. غياب الكالنكسين وإشارات بروتين الغلوبولين المناعي المرتبط في هذه الكسور استبعد التلوث من الأغشية داخل الخلايا ومكونات الشبكة الإندوبلازمية. كشف المجهر الإلكتروني الناقل للأجزاء المخصبة من SEV من F1 إلى F5 عن حويصلات دائرية سليمة ذات طبقات غشائية ثنائية محددة بوضوح وأقطار أقل من 200 نانومتر.
أظهر تحليل تتبع الجسيمات النانوية للعينة المجمعة توزيع حجم أحادي النمط مركزه تحت 200 نانومتر مع متوسط قطر جسيمات يبلغ 147.8 نانومتر. كان تركيز الجسيمات المعدل إلى كتلة الأنسجة هو الأعلى في الكسور الغنية ب SEV من F1 إلى F5 عند 3.7 مضروبة في 10 لقوة ثمانية جسيمات لكل مليليتر لكل ملليغرام من النسيج، وانخفض قليلا في الأجزاء اللاحقة من F6 إلى F8 بمعدل 3.7 مضروبا في 10 إلى قوة ثمانية جسيمات لكل ملليلتر لكل ملليغرام نسيج. يتيح هذا البروتوكول للباحثين قياس حجم وتركيز والحويصلات خارج الخلايا من العضلات ونخاع العظم.
يمكن للأبحاث المستقبلية توسيع هذا البروتوكول ليشمل نماذج الأمراض واستخدام الحويصلات المعزولة لتحديد العلامات الحيوية والأهداف العلاجية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يفصل هذا البروتوكول سير عمل قابل للتكرار لعزل الحويصلات خارج الخلوية الصغيرة (sEVs) من أنسجة العضلات الهيكلية (SkM) ونخاع العظم (BM) لدى الفئران. تخضع العضلات الهيكلية للهضم الإنزيمي، بينما يتم معالجة نخاع العظم مباشرة، يليه عملية الطرد المركزي التفاضلي والكروماتوغرافيا باستبعاد الحجم (SEC) للحصول على أجزاء غنية بالحويصلات خارج الخلوية. تتيح هذه الطريقة عزل الحويصلات خارج الخلوية الصغيرة بنقاء عالٍ من كمية ضئيلة من الأنسجة، مما يدعم التحليلات الجزيئية والوظيفية اللاحقة.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- بيولوجيا الحويصلات خارج الخلوية
- عزل الحويصلات الخاصة بالأنسجة
- توصيف الجسيمات النانوية
خلفية علمية
- تتوسط الحويصلات خارج الخلوية الصغيرة (sEVs) التواصل بين الخلايا عن طريق نقل البروتينات والدهون وأحماض RNA.
- يمثل عزل sEVs من الأنسجة الصلبة مثل العضلات الهيكلية (SkM) ونخاع العظم (BM) تحدياً بسبب انخفاض الإنتاجية والتلوث.
- غالباً ما تتطلب الطرق الحالية كميات كبيرة من الأنسجة وتفتقر إلى إمكانية التكرار.
- يعتبر كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي (SEC) فعالاً لفصل EVs عن الملوثات بناءً على الحجم.
- يتطلب التحقق من نقاء EV استخدام تقنيات متعامدة متعددة.
الغرض من الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لعزل الحويصلات خارج الخلوية الصغيرة (sEV) من العضلات الهيكلية (SkM) ونخاع العظم (BM) للفئران.
- تقليل متطلبات كمية الأنسجة المستخدمة مع زيادة العائد والنقاء إلى أقصى حد.
- تقديم بروتوكول معياري باستخدام الطرد المركزي التفاضلي وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC).
- تمكين التحليلات الجزيئية والوظيفية اللاحقة للحويصلات خارج الخلوية الصغيرة (sEVs) المشتقة من الأنسجة.
- دعم الأبحاث المتعلقة بالتواصل بين الخلايا في الأجهزة العضلية الهيكلية والمكونات المكونة للدم.
الطرق المستخدمة
- الهضم الإنزيمي لأنسجة العضلات الهيكلية.
- المعالجة المباشرة لنخاع العظم بدون معالجة إنزيمية.
- الطرد المركزي التفريقي لإزالة الخلايا والحطام الخلوي.
- كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) لإثراء الحويصلات خارج الخلوية (EV).
- تخلص من أحجام الفراغ (SkM: ~2.5 mL؛ BM: 700 µL) يليه جمع الأجزاء المثرى بالحويصلات خارج الخلوية (EV).
- تقسيم فرعي إلى حصص متتالية (SkM: F1–F4؛ BM: F1–F5).
- المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) لتقييم المورفولوجيا.
- تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) لتحديد الحجم والتركيز.
- لطخة ويسترن لعلامات الحويصلات خارج الخلوية (EV) القياسية (مثل tetraspanins).
- الكشف التداخلي للجسيمات المفردة (SPID) لتقدير كمية المجموعات الفرعية المحددة ببروتينات tetraspanin.
النتائج الرئيسية
- تم عزل hEVs من حوالي 500 µL من العضلة رباعية الرؤوس وحوالي 150 µL من نخاع العظم المجمع من الفخذ والظنبوب.
- بلغ الإنتاج حوالي 10⁸ جزيء·mL⁻¹·mg⁻¹ من النسيج.
- كانت أقطار الجزيئات في الغالب أقل من 200 nm.
- تم التحقق من صحة الأجزاء الغنية بـ EV بواسطة TEM و NTA و Western blotting.
- أتاح تقنية SPID قياس الكميات في المجموعات الفرعية من sEV الموجبة للتتراسبانين.
- تنتج هذه الطريقة sEVs عالية النقاء ومناسبة لاختبارات الأوميكس والتحاليل الوظيفية اللاحقة.
الاستنتاجات
- يتيح هذا البروتوكول عزل hEVs بنقاء عالٍ وقابلية للتكرار من الأنسجة المعقدة بنيوياً.
- تكفي أحجام محدودة من الأنسجة المدخلة للحصول على عائد قوي من EV.
- يقلل الاستخدام المشترك للطرد المركزي التفاضلي وSEC من التلوث.
- يؤكد التحقق المتعامد سلامة الحويصلات ونقاءها.
- يدعم هذا النهج الدراسات المتقدمة لوظائف sEV النوعية للأنسجة في حالتي الصحة والمرض.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
لا يزال عزل الحويصلات خارج الخلوية الصغيرة (sEVs) من الأنسجة الصلبة، مثل العضلات الهيكلية ونخاع العظم، يمثل عقبة في اكتشاف المؤشرات الحيوية والدراسات الميكانيكية بسبب انخفاض الإنتاجية وحدوث التلوث. يتيح هذا البروتوكول عزل sEVs بنقاوة عالية وقابلية للتكرار من كميات محدودة من الأنسجة، مما يدعم التحقق من الأهداف والمسح المظهري في نماذج الأمراض العضلية الهيكلية وأمراض الدم. ومن خلال تقليل الضجيج البيولوجي وتحسين نقاوة الحويصلات، تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في تحليلات الأوميكس (omics) والمقاييس الوظيفية اللاحقة.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير للمستحضرات الصيدلانية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- القيمة العلمية: يتيح استقصاء مسارات التواصل بين الخلايا النوعية للأنسجة عبر نقل البروتينات والدهون والحمض النووي الريبي (RNAs) بوساطة الحويصلات خارج الخلوية الصغيرة (sEVs).
- القيمة التشغيلية: يوفر سير عمل قابلاً للتكرار لعزل hويصلات خارج الخلوية صغيرة (sEVs) من العضلات الهيكلية ونخاع العظام للفئران باستخدام الطرد المركزي التفاضلي وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم.
- القيمة العلمية: يدعم تقليل المخاطر البيولوجية من خلال التحقق من إثراء الحويصلات خارج الخلوية (EV) عبر طرق متعامدة تشمل المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)، وبصمة ويسترن (Western blotting)، والكشف التداخلي للجسيمات الفردية.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: ينتج أجزاءً غنية بـ EV بأقطار جسيمات تقل غالباً عن 200 nm ومردود يصل إلى ~10⁸ particles·mL⁻¹·mg⁻¹ من الأنسجة، مما يتيح مدخلات متسقة لحملات الفرز.
- القيمة التشغيلية: يوحد عملية عزل sEV من خلال التخلص المحدد من الحجم الفارغ والتجزئة المتتابعة (SkM: F1–F4؛ BM: F1–F5)، مما يحسن من قابلية تكرار المقايسة عبر المختبرات.
- القيمة العلمية: يسهل تحضير أنظمة بيولوجية معتمدة للتحليلات الجزيئية اللاحقة، مثل البروتيوميات وتوصيف RNA للحويصلات المشتقة من الأنسجة.
الأبحاث الانتقالية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يدعم الأنظمة ذات الصلة بالأمراض من خلال تمكين عزل hसीsEVs من العضلات الهيكلية ونخاع العظم، وهي أنسجة مركزية في الفيزيولوجيا المرضية للجهاز العضلي الهيكلي وتكوين الدم.
- القيمة التشغيلية: يستخدم الحد الأدنى من المواد المدخلة (~500 µL من العضلة رباعية الرؤوس، ~150 µL من نخاع عظم الفخذ/الظنبوب المجمع)، مما يسمح بمعالجة قابلة للتوسع للعينات قبل السريرية المحدودة.
- القيمة العلمية: يعزز مواءمة المؤشرات الحيوية الانتقالية من خلال عزل مجموعات فرعية من sEVs المحددة بواسطة tetraspanin والتي يمكن قياسها كمياً عبر الكشف التداخلي للجزيئات المفردة.
تكامل مسارات العمل ومنظومة التشغيل
تندرج هذه الطريقة ضمن تسلسل الاكتشاف بدءاً من التحقق الأولي من الهدف وصولاً إلى الدراسات الميكانيكية قبل السريرية، مما يتيح عزل الحويصلات خارج الخلوية الصغيرة (sEVs) المشتقة من الأنسجة بشكل موثوق لاختبار الفرضيات وتوضيح المسارات.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات من خلال عزل الحويصلات خارج الخلوية الصغيرة (sEVs) التي تتوسط التواصل بين الخلايا في البيئات الدقيقة للعضلات الهيكلية ونخاع العظم.
- الفحص: يوفر أجزاءً من الحويصلات خارج الخلوية (EVs) مفصولة بناءً على الحجم وجاهزة للمقايسة مع تقليل التلوث، مما يعزز موثوقية تقييمات الاستجابة للمركبات أو المحفزات.
- التحليلات: يولد مخرجات كمية تشمل تركيز الجسيمات، وتوزيع الحجم (<200 nm)، وبيانات المجموعات الفرعية لبروتينات التتراسبانين (tetraspanin) لتمكين التحليل المقارن عبر ظروف مختلفة.
- الأبحاث الترجمية: يربط مرحلة الاكتشاف بالاستمرارية قبل السريرية من خلال توفير sEVs منقاة ومناسبة لمقايسات الالتقاط الوظيفي وإشارات الخلايا في نماذج الأمراض.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يؤسس منصة عزل معيارية وقابلة لإعادة الاستخدام، يمكن تطبيقها عبر برامج أبحاث الجهاز العضلي الهيكلي والجهاز المكون للدم.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزز الثقة التنبؤية عن طريق تقليل الغموض الميكانيكي من خلال عزل sEV عالية النقاء تم التحقق من صحتها باستخدام تقنيات متعامدة متعددة.
- القيمة التشغيلية: تعزز التوحيد القياسي وقابلية التكرار من خلال بروتوكولات محددة لتجزئة SEC والتخلص من حجم الفراغ.
- القيمة الاستراتيجية: تحسن قرارات المضي قدماً أو التوقف (go/no-go) من خلال تمكين التقييم الموثوق لشحنات الحويصلات الخاصة بالأنسجة في مراحل الاكتشاف المبكرة.
- تأثير المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال توفير مدخلات sEV متسقة لدراسات التحقق من المؤشرات الحيوية والأهداف.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في التعامل مع الأنسجة، والهضم الإنزيمي (للعضلات الهيكلية)، وتقنيات الطرد المركزي.
- يعتمد على توفر أعمدة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم، وتحليل تتبع الجسيمات النانوية، وبنية تحليل لطخة ويسترن (Western blotting).
- يستلزم توحيد معايير جمع الأجزاء وتجميعها بين الفرق بناءً على إثراء مؤشرات الحويصلات خارج الخلوية (EV).
- يتضمن اعتبارات التكيف عند التطبيق على أنسجة صلبة أخرى نظراً للاختلافات في كثافة المصفوفة خارج الخلوية والخلوية.
- قيد عملي: تؤدي الإنتاجية المطلقة المنخفضة من مدخلات الأنسجة الصغيرة إلى ضرورة استخدام طرق كشف حساسة في المراحل اللاحقة لتطبيقاتات الأوميكس (omics).
