تحديد الهيستونات المعدلة كركائز ارتباط لعضو عائلة سبيندلين البشري 4 (SPIN4) بواسطة مصفوفات الببتيدات وسحب النيوكليوسوم الأصلي
مارس 27, 2026
تم مؤخرا تحديد متغيرات جينية في عضو عائلة سبيندلين البشري 4 (SPIN4) لدى مرضى يعانون من فرط نمو العظام، وهو اضطراب تطوري جديد. تم تقديم بروتوكول ونتائج جديدة تصف التعرف الكيميائي الحيوي للهستونات المعدلة في سياق النيوكليوسومات كركائز ارتباط SPIN4.
SPIN4 هو قارئ هيستوني منظم لتطور العظام. تسبب طفرات SPIN4 النمو الزائد، لكن دورها الممرض لا يزال غير واضح. يمكن تكييف هذا البروتوكول وتطبيقه لدراسة ركائز الارتباط بالبروتينات المرتبطة بالهيستون عبر جميع المساحات.
للبدء، جهز المحلول الحاجز بوزن خمسة جرامات من ألبومين مصل البقر (BSA)، وذوبه إلى 100 ملليلتر من محلول تخزين بروتين BC-150. بعد ذلك، استخدم قلما كاره للماء لتحديد منطقة التفاعل على مصفوفة الببتيدات للحفاظ على الكواشف. ثم ضع أوراق الترشيح في طبق بتيري بقطر 15 سنتيمتر ورطبها بالماء.
ضع المصفوفات على أوراق مرشحة مبللة وأضف 300 ميكرولتر من حاجز العزل بحذر لكل منطقة مصفوفة بعناية. غط واحتضن طبق بتري في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة إلى ثلاث ساعات. جهز ميكرومولار واحدا من بروتين SPINDLIN-4 المؤتلف FLAG الموسوم ب Spindlin-4، وببتيد 1X FLAG، كل منهما في مخزن حاجز.
انقل الكواشف وطبق المصفوفة إلى غرفة باردة لتقليل الخلفية وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء. أزل حاجز العزل الزائد من المصفوفات. أضف بروتين FLAG SPIN4، أو التحكم الببتيد FLAG، إلى كل كتلة.
غط طبق البتري للحضانة طوال الليل في الغرفة الباردة. أضف 50 ملليلتر من محلول الغسيل من مصفوفة الببتيد إلى صندوق الغسيل. تخلص من محلول البروتين من المصفوفات وانقله إلى مخزن الغسيل مع جانب التفاعل للأعلى.
اغسل المصفوفات خمس مرات. قم بأول غسلتين لمدة دقيقة لكل منهما، تليها ثلاث غسلات متتالية مدة كل منها خمس دقائق. ثم اشطف بمحلول حاجز لإزالة المغسلات المتبقية.
أعد المصفوفات إلى طبق بيتري. أضف 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة المضادة FLAG إلى كل كتلة وحضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من محلول الأجسام المضادة، وانقل المصفوفات إلى مخزن الغسيل، وكرر عمليات الغسيل كما تم شرحها سابقا.
أضف 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية IgG المضاد للفأر الماعز المتقارن ب HRP إلى كل كتلة وحضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من محلول الأجسام المضادة واغسل المصفوفة خمس مرات كما هو موضح سابقا. ضع المصفوفات داخل واقي صفائح شفاف وأضف ملليتر واحد من الإضاءة الكيميائية المعززة، أو ركيزة ECL، لضمان تغطية متساوية.
أزل فقاعات الهواء المحبوسة. التقاط الإضاءة الكيميائية في الصور ذات المجال الساطع باستخدام جهاز تصوير رقمي. بعد رفع ملف البيانات الخام إلى برنامج تحليل مصفوفة الببتيدات الهيستونية المود، في تبويب محاذاة البقعة، تأكد من أن كل شبكة مركزة حول نقطة الببتيد الخاصة بها.
في الإحصائيات النقطية، تحقق من الارتباط النقطي المكرر وتأكد من أن الخطأ أقل من 5٪. استخدم تبويب التفاعلية لتقييم الارتباط عبر مختلف تعديلات الهستون. ثم استخدم تبويب الخصوصية لتحديد تفضيل ارتباط الببتيد المستهدف بين تعديلات الهيستون المختلفة. لتحضير مخزن حجب خرزتين مرتين (BE) للحجب من الخرز، أضف جراما واحدا من BSA إلى 10 ملليلتر من مخزن تحليل BC-150 ودوامة للذوبان.
نقل خرزات FLAG SPIN4 من النوع البري وخرز FLAG SPIN4 D82H الطفرة التي تحتوي على تركيزات متساوية في أنابيب منفصلة بسعة 1.5 ملليتر. أضف إلى العينة البرية حجم متساو من خرزات تحكم سلبية بتيد 1X FLAG بحجم 100 مليمولر. ضبط جميع العينات إلى أحجام منتظمة باستخدام كمية مناسبة من مخزن التحلل BC-150.
أضف حجم متساوي من مخزن حجب الخرز 2X لكل أنبوب لتكوين الحجم النهائي إلى ملليلتر واحد. حضن الأنابيب طوال الليل على مدور أنابيب مضبوط على أربع درجات مئوية و20 دورة في الدقيقة. لبدء ارتباط النيوكليوسومات، قم بإذابة 1X من مونونيوكليوسومات المستخرجة من HEK293FT الخلايا على الجليد.
للتحسين الأولي، احسب نسبة مولية واحدة إلى واحدة من 1X نيوكليوسوم إلى بروتين SPIN4. اخلط 1X نيوكليوسوم مع حجم متساوي من مخزن حجب الخرزات 2X. ثم ادمج الخليط مع خرزات مسبقة مسبقا في أنبوب بسعة 15 ملليتر وحضن الخليط لمدة أربع ساعات على دوار الأنبوب عند أربع درجات مئوية و20 دورة في الدقيقة للتعقيد.
قم بعمل طرد مركزي على حرارة 3000 جرام لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد التخلص من السوبرناتانت، أعد تعليق الخرزات في ملليلتر واحد من محلول التحلل BC-150 وانقل إلى أنابيب بسعة 1.5 مليليتر. لغسل الخرزات ثلاث مرات، استخدم الطرد المركزي عند 3000 جرام لمدة دقيقة واحدة.
بعد التخلص من السوبرناتانت، أعد تعليق الحبيبة في ملليلتر واحد من محلول التحلل BC-150. حرك الأنبوب أحيانا لتوزيع الخرز بشكل موحد بين الغسلات المتكررة. ثم قم بغسلتين إضافيتين، تتضمن خطوة حضانة مدتها 10 دقائق على مدور عند 20 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية بين خطوات إعادة التعليق والطرد المركزي.
بعد الغسل النهائي، أعد تعليق الخرزات في تسعة أعمدة من مخزن التحلل BC-150. اخلط 160 ميكرولتر من الخرزات من كل عينة مع 40 ميكرولتر من مخزن Laemmli 5X Laemmli. سخن على 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لإزالة الطابع.
اختياريا، للحصول على نتائج أنظف مع خلفية أقل، يتم تنفيذ وهم ببتيد FLAG لمجمع النيوكليوسوم البروتيني. الطرد المركزي على 3000 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بتليين الفضة والتلوين الغربي للتحقق من واكتشاف ارتباط SPIN4 المعدل ب Histone SPIN4.
يرتبط SPIN4 بشكل كبير بببتيدات هيستون H3 ليسين 4، أو H3K4، وأحادي الميثيل وثنائي الميثيل وثلاثي الميثيل. وعلى العكس، أظهر طفرة فقدان الوظيفة في SPIN4 D82H ارتباطا أقل بجميع الأهداف، مما يؤكد أن مجال تيودور 1 ضروري لارتباط الركيزة. تتأثر تقارب SPIN4 سلبا بتعديلات ما بعد الترجمة التي تصر على تأكيداتها، مثل H3R2me2s و H3R2me2a.
ملاحظات متسقة لمصفوفات الببتيدات، أظهر SPIN4 D82H انخفاضا عاما في ارتباط النيوكليوسومات مقارنة بنوع SPIN4 البري. أظهر تحليل البلوت الغربي الذي قارن عينات السحب من SPIN4 وSPIN4 D82H أيضا عدم ارتباط قابل للقياس بين SPIN4 D82H بببتيدات أحادية الميثيل أو ثنائي ميثيل أو ثلاثي ميثيل H3K4، مما أكد صحة هذه الأساليب المزدوجة لتحديد ركائز تعديل الهيستون النسبية بعد الترجمة بسرعة. التحقق السريع والمستهدف لركائز الارتباط في بروتينات الارتباط بالهيستون.
قد تختلف الشروط المطلوبة للتعبير والتنقية عن بروتينات ارتباط الهيستون لكل مرشح. مطياف كتلة هيستون بعد سحب المونونيوكليوسوم الأصلي سيعطي النطاق الكامل لPTMs الهستوني.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
Overview
This article presents a protocol for identifying the binding substrates of human Spindlin Family Member 4 (SPIN4), a histone reader implicated in bone growth regulation. The study details the use of peptide arrays and nucleosome pulldown assays to characterize the binding specificity of wild-type and mutant SPIN4, providing insights into its role as an epigenetic reader and its involvement in overgrowth syndromes.
Key Study Components
Area of Science
- Epigenetics
- Protein biochemistry
- Bone biology
Background
- SPIN4 is a histone reader protein involved in bone development.
- Loss-of-function mutations in SPIN4 are linked to pre- and post-natal overgrowth syndromes with X-linked dominant inheritance.
- SPIN4 contains three Tudor domains, which are potential epigenetic reader domains for methylated histone residues.
- The precise binding substrates and functional mechanisms of SPIN4 were previously unclear.
Purpose of Study
- To identify and validate the histone binding substrates of SPIN4.
- To compare the binding affinities of wild-type and disease-associated mutant SPIN4.
- To establish a rapid protocol for substrate identification of histone-binding proteins.
Methods Used
- Expression and purification of recombinant FLAG-tagged SPIN4 (wild-type and D82H mutant) using an insect cell system.
- Histone modification peptide array to assess binding specificity and affinity.
- Biochemical pulldown assays using native mononucleosomes extracted from HEK293FT cells.
- Silver staining and Western blotting to validate histone binding.
- Data analysis using MODified Histone Peptide Array Analysis software.
Main Results
- Wild-type SPIN4 binds specifically to histone H3 lysine 4 (H3K4) mono-, di-, and trimethylated peptides.
- The D82H loss-of-function mutant exhibits significantly reduced binding to all H3K4 methylation states, indicating the importance of Tudor domain 1.
- SPIN4 binding is negatively affected by additional post-translational modifications such as H3R2me2s and H3R2me2a.
- Western blot and peptide array results consistently show diminished nucleosome binding by the mutant compared to wild-type SPIN4.
Conclusions
- SPIN4 is a bona fide reader of H3K4 methylation marks.
- The D82H mutation disrupts SPIN4's substrate binding, highlighting the functional significance of Tudor domain 1.
- This protocol enables rapid and targeted identification of histone-binding protein substrates and can be adapted for other candidates.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Rapid identification of histone-binding substrates for epigenetic reader proteins like SPIN4 is critical for de-risking early discovery and clarifying target mechanisms in chromatin biology. This protocol enables quantitative assessment of binding specificity and functional validation, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. The approach is directly relevant for portfolio triage and prioritization of epigenetic targets in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of epigenetic reader protein substrate specificity for mechanistic de-risking.
- Supports functional target validation by distinguishing wild-type from loss-of-function variants.
- Provides quantitative binding data to inform predictive confidence in target selection.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated peptide arrays and nucleosome pulldown assays for downstream workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative readouts for assay development.
- Enables reliable evaluation of compound or variant effects on histone binding.
Translational & Preclinical Research
- Aligns substrate identification with disease-relevant epigenetic mechanisms for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying functional consequences of mutations.
- Provides a platform for biomarker alignment in chromatin-modifying target programs.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early target validation through assay development and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for epigenetic reader proteins.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative, and reproducible binding data for screening campaigns.
- Analytics: Delivers statistical outputs and comparative measurements for variant and condition assessment.
- Translational Research: Connects substrate specificity to disease-relevant chromatin states when supported by functional data.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol adaptable to other histone-binding protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in epigenetic target validation.
- Operational Value: Standardizes substrate identification and enables reproducible, scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying target engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of chromatin-modifying targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein expression, peptide array handling, and chromatin biochemistry.
- Needs access to digital imaging, peptide array analysis software, and Western blot infrastructure.
- Demands cross-team standardization for data analysis and interpretation.
- Adaptation may be necessary for different histone-binding proteins or model systems.
- Expression and purification conditions may vary for each candidate protein, impacting throughput.
