طريقة محسنة لعزل الظهارة الإحليل في إناث الفأر لتحليل الخلايا الأحادية والتحليل المناعي الفلوري

تهتم مجموعتنا بدراسة أنماط الظهارة في الجهاز البولي التناسلي. يمثل هذا البروتوكول طريقة محسنة لعزل بطانة الظهارة في إحليل الفأر الأنثوي للتحليل الجزيئي والخلوي لاحقا. ستساعد الطرق الموضحة في هذه الورقة في البحث حول بطانة الإحليل الأنثوية ودورها في الدفاع المناعي.

للبدء، ضع أنثى الفأر المدمجة في CD1 التي تم رحيمها في وضعية الاستلقاء على طاولة التشريح. رش 70٪ إيثانول على البطن لترطيب الشعر. باستخدام الملقط، ارفع الجلد على البطن.

ثم باستخدام مقص صغير، قم بعمل شق عمودي باتجاه الجزء السفلي من الجسم وينتهي عند فتحة الإحليل الخارجية. حدد المثانة ورفعها بلطف باستخدام الملقط، مع التأكد من أنها فارغة وخالية من البول. باستخدام المقص، قم بقص الدهون والأنسجة الضامة حول المثانة لكشف البنية على شكل فراشة حيث تلتقي عظمتا العانة عند التكافل العاني.

راقب الإحليل وهو يمر تحت التعايش العاني. ثم ارفع الشعور العصبي العانة بالملقط وقطعه بالمقص. قم بإزالة شظايا عظم العانة لكشف الإحليل الرقيق الموجود على السطح البطني لجدار المهبل.

باستخدام ملقط دقيق، اسحب المثانة بلطف للأعلى من تجويف الجسم. مرري المقص بين الإحليل وجدار المهبل لفصل المسالك البولية عن الجهاز التناسلي. حافظ على توتر خفيف على المثانة أثناء القطع على طول الجزء الخلفي من الإحليل لفصله عن جدار المهبل.

استمر في القطع إلى فتحة الإحليل البعيدة للحصول على إحليل الفأر الكامل الطول، الذي يتراوح طوله بين 1.2 إلى 1.5 سنتيمتر. بعد ذلك، افصل الإحليل عن المثانة عن طريق عمل قطع واحد في عنق المثانة. تجمع أربعة إلى خمسة إحليل في طبق بتري معقم يحتوي على HBSS طازج خال من الكالسيوم والمغنيسيوم.

تحت المجهر التشريحي، قم بقص الدهون والأنسجة الضامة حول الإحليل باستخدام ملقط دقيق ومقص. ثم بالمقص، اقطع كل إحليل بشكل عرضي إلى قطعتين متساويتين الحجم. ضع قطع الأنسجة فوق مصفاة نايلون بقوة 100 ميكرون.

اغسل قطع الأنسجة بملليتر واحد من HBSS، ثم انقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر يحتوي على ملليتر واحد من 1٪ تريبسين محضر في HBSS مع مضادات حيوية ومضادات للميميكوت. بعد ذلك، حضن العينة على المدور بسرعة 30 دورة في الدقيقة وأربع درجات مئوية لمدة 15 إلى 30 دقيقة. بعد الهضم، أضف 10 ملليمولات من كلوريد المغنيسيوم المحضر في HBSS إلى الأنبوب، تليها 10 ميكروغرامات لكل ملليلتر من إنزيمات DNAse التي أعددتها في PBS.

حضن الأنبوب لمدة 15 إلى 30 دقيقة على مدور موضوع داخل فرن هجين بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. لتبريد التربسين، انقل أنسجة الإحليل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 10٪ مصل أغنام في HBSS عند درجة حرارة الغرفة. بعد خمس دقائق، انقل أنسجة الإحليل إلى أنبوب جديد يحتوي على HBSS بارد مثلج، ثم إلى طبق بتوري معقم يحتوي على HBSS بارد مثلج.

أثناء مشاهدة العينة تحت المجهر، أمسك أحد طرفي قطعة الإحليل بملقط. باستخدام زوج آخر من الملقط، مرر طول قطعة الإحليل بالكامل لبثق صفيحة الظهارة الشفافة. عالج بعض صفائح الظهارة المعزولة في الإحليل مباشرة لتلطيخ المناعة الكاملة لرؤية خلايا الظهارة والبلاعم المرتبطة بالظهارة في الموقع.

استخدم ماصة بلاستيكية صغيرة لنقل قطع الظهارة في قطرة من HBSS معزولة من أربعة إلى خمسة إحليل فأر متجمع إلى طبق بتري معقم. استخدم المقص لتقطيع الظهارة إلى شظايا صغيرة. انقل شظايا الظهارة المفروم إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة ملليترين يحتوي على 1.5 ملليلتر من محلول الهضم المسخن مسبقا من أكوتاز عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

حضن العينة على جهاز دوار عند 37 درجة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة، انقل المحتويات كاملة إلى أنبوب طرد مركزي بسعة خمسة مليليتر يحتوي على ملليلتر من محلول الغسيل المكون من 1X PBS و1٪ BSA خال من الكالسيوم والمغنيسيوم. قم بطرد المركزي في نظام التعليق عند 600 جيلون لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية باستخدام دوار دلو متأرجح.

بعد ذلك، استنشق السوبرناتينت باستخدام مكنسة كهربائية لطيفة. ثم استخدم ماصة رأس فلتر بسعة ملليلتر واحد لإعادة تعليق الحبيبة في محلول غسيل واحد ملليتر. قم بتقسيم الحبيبات عن طريق الرش للأعلى والأسفل حتى تصبح الكتل أصغر.

مرر نظام التعليق عبر إبر بقياس 23.5 و26.5، كل منها متصل بحقنة بسعة ملليلتر واحد باستخدام أربع أشواط لكل إبرة. بعد ذلك، أضف ملليتر واحد من محلول الغسيل لترطيب سطح فلتر ما قبل الفصل بسعة 30 ميكرون فوق أنبوب بسعة خمسة ملليتر. باستخدام الحقنة المتصلة بإبرة قياس 26.5، انقل ملليلتر واحد من تعليق الخلية عبر الفلتر.

ثم اغسل الأنبوب بملليتر واحد من محلول الغسيل ومرره عبر الفلتر. قم بتفجير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 600 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية باستخدام دوار دلو متأرجح. استنشق السوبرناتان.

أعد تعليق الحبيبة في 100 ميكرولتر من محلول الغسيل وأضف 100 ميكرولتر من مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء. بعد ثلاث دقائق بالضبط، أضف أربعة ملليلتر من محلول الغسيل وامزج. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 600 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية باستخدام دوار دلو متأرجح.

قم بإزالة المادة الفائقة قبل إعادة تعليق الحبيبة في 50 إلى 200 ميكرولتر من محلول الغسيل حسب حجم الحبيبة. اخلط خمسة ميكرولتر من الخلايا مع خمسة ميكرولترات من تريبان بلو وحمل الخليط على جهاز قياس الدم لتقييم إنتاجية الخلايا وقابليتها. تقييم بقاء الخلايا وقياس مجموعات الخلايا المميزة باستخدام قياس تدفق الخلية.

زراعة خلايا أحادية للظهارة الإحليل في مصفوفة غشاء قاعدي ووسط توسع عضوي لتوليد عضويات ظهارية ثلاثية الأبعاد. إجراء تلوين الإيوسين بالهيماتوكسيلين وصبغ المناعي الفلوري على الأقسام العضوية المدمجة لرؤية بنية العضوية وتركيب الخلية. كانت الأغلفة الظهارية المعزولة في الإحليل أكثر شفافية من نسيج البسكوما بعد الفصل.

أظهر التلوين المناعي الكامل للغمد الطلائي علامات قوية باستخدام الجسم المضاد E-cadherin CDH1. وسم الصفائح بالجسم المضاد ل F480 أظهر أن البلعم تشكل هياكل شجرية متفرعة بين خلايا الظهارة في الإحليل. أظهرت الخلايا المفردة المعزولة من ظهارة الإحليل قابلية عالية باستمرار للبقاء من خلال استبعاد التريبان الأزرق على جهاز قياس الدم وقياس تدفق الخلايا باستخدام صبغة الشبح V 450 التفاعلية ضد الأمين.

احتوت الخلايا المعزولة على مجموعة خلايا ظهارية غنية بعد الانتقال إلى الخلايا الحية. لوحظ حوالي 1.3٪ من خلايا المناعة الموجبة CD45 و1.18٪ من الخلايا البلعمية في التعليقات المفردة الخلية. ظلت الخلايا الظهارية المفردة المعزولة من الإحليل قادرة على الحياة وشكلت عضويات في مصفوفة ثلاثية الأبعاد مع ملاحظة نمو عضوي حتى اليوم السادس في الزراعة.

أظهر تلوين الإيوسين بالهيماتوكسيلين شكلين مميزين للعضويات الظهارية الإحليلية، بما في ذلك العضوية المجوفة الكبيرة والعضويات الصلبة الأصغر. تم تقسيم كل من الأعضاء الظهارية المجوفة والصلب في الإحليل والتعبير عنها ب KRT5 وP63 في الطبقة الأساسية. عبروا عن KRT-13 في الطبقات الخلوية فوق القاعدية والمتوسطة.

أظهرت الأعضاء الناتجة من الإحليل القريب نسبة أعلى من الأعضاء المجوفة، بينما شكلت الأعضاء الناتجة من الإحليل البعيد المزيد من الكرات الصلبة. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة أنواع خلايا الإحليل وقدرتها على التجدد الذاتي من الإحليل القريب والبعيد. واحدة من أهم اعتبارات هذا البروتوكول هي التشريح الدقيق للإحليل الكامل وتحسين الهضم الإنزيمي للحصول على خلايا ظهارية إحليل قابلة للتحليل لاحقا.

يمكن استخدام الخلايا الطهارية التي ينتجها هذا البروتوكول في تطبيقات متعددة، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية، وتسلسل الحمض النووي الريبي الضخم، وقياس تدفق الخلية، والتلوين المناعي، وزراعة العضويات.