طريقة متكاملة لنمذجة السكتة الضوئية وتسجيل الأوبترود البصري للنشاط العصبي والنجمي في الفئران السلوكية

يطور بحثنا طريقة متكاملة لتسجيل نشاط الخلايا النجمية والعصبونات بشكل متزامن أثناء السكتة الدماغية الإقفارية في الفئران التي تظهر سلوكاً حركياً. كانت الطرق السابقة تسجل نشاط العصبونات أو الخلايا النجمية بشكل منفصل، بينما يقوم البروتوكول الخاص بنا بالتقاط إشارات الخلايا النجمية والعصبونات في آن واحد منذ اللحظات الأولى لبداية السكتة الدماغية.

في البداية، يتم نقل فأر C57BL/6J تحت تخدير عميق إلى الإطار التجسيمي المجهز بقناع تخدير. يتم مراقبة عمق التخدير كل 10 دقائق مع الحفاظ على درجة حرارة جسم الفأر بين 36 إلى 37.5 درجة Celsius باستخدام وسادة تسخين يتم التحكم بها عبر نظام تغذية راجعة. يتم تثبيت الفأر في الإطار التجسيمي باستخدام قضبان الأذن وقضيب الفم بعد وضع مرهم عيني على العينين.

تأكد من تثبيت الرأس عن طريق الجس اللطيف بمجرد تثبيت الرأس بشكل متماثل. بعد إزالة الشعر وإجراء تحضير معقم للجلد، استخدم مقصاً جراحياً لعمل شق في الخط الناصف. نظف السمحاق باستخدام المحلول الملحي والمسحات القطنية للكشف عن منطقة البريغما (bregma) واللامبدا (lambda).

قم بخفض الماصة الزجاجية الدقيقة لتلامس نقطتي البريغما (bregma) واللامدا (lambda) بالتتابع. بعد تسجيل إحداثي Z على القدمة ذات الورنية الرقمية، اضبط قضيب الفم حتى يصبح الفرق أقل من 0.04 مليمتر. أخفض الماصة الزجاجية الدقيقة لتلامس البريغما، ثم أعد ضبط القدمة ذات الورنية الرقمية إلى الصفر.

حرك الماصة الدقيقة مسافة 2.3 مليمتر إلى يسار ويمين البريغما (bregma) على التوالي. وبعد تسجيل إحداثيات محور Z، اضبط قضبان الأذن حتى تصبح الفروق الثنائية أقل من 0.04 مليمتر. بعد إعادة ضبط الفرجار الرقمي إلى الصفر عند البريغما، حدد منطقة الطرف الأمامي في القشرة المحركة عند الإحداثيات الأمامية الخلفية +1.5 مليمتر والإحداثيات الإنسية الجانبية +0.74 مليمتر.

استخدم مثقاباً دقيقاً وريش مثقاب مستديرة الرأس بقطر 0.5 millimeter لحفر ثقب صغير، يبلغ قطره 0.94 millimeters تقريباً عند الموقع المحدد. قبل التحميل، اخلط الناقلين الفيروسيّين المرتبطين بالغدّيات (adeno-associated viral vectors) بأحجام متساوية ثم قم بطرد العينة مركزياً لفترة وجيزة. أنزل الماصة الزجاجية الدقيقة المتصلة بمضخة الحقن الدقيق إلى الموقع المستهدف على عمق ظهري-بطني يبلغ 0.94- millimeters من سطح الدماغ.

قم بحقن 400 نانوليتر من الخليط الفيروسي الذي يحتوي على 200 نانوليتر من كل ناقل بمعدل 50 نانوليتر في الدقيقة. اسحب الماصة ببطء بعد مرور 10 دقائق من اكتمال عملية الحقن. قم بخياطة فروة الرأس باستخدام خيط جراحي 4-0 بطول 20 مليمتر، وإبرة دائرية 3/8، ثم ضع الفأر على وسادة تدفئة حتى يتماثل للشفاء التام.

بعد مرور ثلاثة إلى أربعة أسابيع من الحقن الفيروسي، اتبع الإجراء الذي تم شرحه مسبقاً وصولاً إلى شق فروة الرأس. أثناء عملية شق فروة الرأس، قم بإزالة منطقة بمساحة 1.5 سنتيمتر في 1.5 سنتيمتر من الفروة مع الحفاظ على كمية كافية من الجلد حول العينين. نظف الجمجمة باستخدام بيروكسيد الهيدروجين ومحلول ملحي بتركيز 0.9%.

بعد تحديد نقطة البريغما (bregma)، قم بتصفير القدمة الورنية الرقمية. استخدم مثقاباً ذا رأس مستدير بقطر 0.8 مليمتر لإحداث خشونة خفيفة على سطح الجمجمة. حدد منطقة القشرة الحركية للطرف الأمامي.

عند الإحداثيات الأمامية الخلفية 1.5 millimeters والجانبية الإنسية 0.74 millimeters. استخدم العلامة كنقطة مركز لرسم مربع بمقاس خمسة مليمترات في خمسة مليمترات. استخدم مثقاباً دقيقاً بسرعة دوران تبلغ 10,000 revolutions per minute تقريباً لتحديد محيط المربع.

استمر في وضع المحلول الملحي المبرد بالثلج على مسار الحفر وتوقف فوراً إذا تخلخلت السديلة العظمية. احفر ثلاث ثقوب صغيرة بقطر 0.5 millimeter فوق نصف الكرة المخية المقابل والمخيخ. ازرع براغي ترقيع الجمجمة في الثقوب.

تأكد من وصول كل برغي إلى الأم الجافية دون اختراقها بشكل أعمق لتجنب إتلاف أنسجة الدماغ. استخدم الملاقط لإزالة السديلة العظمية التي تم إرخاؤها. استخدم ملاقط فائقة الدقة ذات طرف أصغر من 0.03 مليمتر في 0.01 مليمتر لإزالة الأم الجافية عند النافذة القحفية مع تجنب الملامسة المباشرة لأنسجة الدماغ.

قم بتثبيت المسبار الضوئي (optrode) بذراع الميكرومانيبيوليتور (micromanipulator) في الإطار التجسيمي (stereotaxic frame)، ثم حركه ليصبح فوق النافذة القحفية. قم بلف أسلاك التأريض والمرجع الفضية الخاصة بالمسبار الضوئي بإحكام حول براغي ترميم الجمجمة الثلاثة. نظف سطح النافذة القحفية باستخدام محلول ملحي معقم.

قم بخفض جهاز الـ optro ببطء إلى العمق الظهري البطني المطلوب وهو 0.94- مليمتر، بمعدل مليمتر واحد كل 10 ثوانٍ. ضع طبقة من الأجاروز فوق النافذة القحفية بعد عملية الزرع. ثم ضع ثلاث إلى أربع طبقات من الأسمنت السني.

بمجرد تصلب الإسمنت السني، يتم تقديم المسكنات لمدة تتراوح بين ثلاثة إلى خمسة أيام، مع ترك الفأر لفترة تعافٍ تمتد من أسبوع إلى أسبوعين. استخدم نظام قياس الفلورية بالألياف (fiber photometry) ثنائي أو ثلاثي الطول الموجي لإثارة GCaMP6s. اضبط قناة الإشارة على 470 nanometers وقناة التحكم على 410 nanometers.

اضبط معدل أخذ العينات على 60 إطاراً في الثانية. الآن، قم بتأريض جميع مكونات نظام التسجيل بشكل صحيح. استخدم مرجعاً متوسطاً مشتركاً أثناء التسجيل.

تحقق من اختيار إشارات النطاق العريض وجهد المجال المحلي في برنامج التسجيل مع مراقبة الضوضاء طوال جلسة التسجيل. بعد تخدير الفأر لفترة وجيزة، قم بتوصيل الـ optro بخط التسجيل عبر محول. ضع الفأر في بيئة شبيهة بالقفص المنزلي لإجراء التسجيل.

اترك فترة 10 دقائق للتأقلم بعد الاستيقاظ. قم بتسجيل الفأر أثناء إجراء اختبار قوة القبضة، مع طلب سحبة واحدة كل دقيقة لمدة خمس دقائق. قم بتوثيق الطوابع الزمنية للاختبارات السلوكية بدقة في كل من أنظمة القنوات المتعددة وقياس الفلورية الليفية.

يتم حقن محلول صبغة Rose Bengal بتركيز 1.5% داخل الصفاق بجرعة تتراوح بين 10 إلى 20 مليجرام لكل كيلوجرام، مع الانتظار لمدة خمس دقائق. وبمجرد تحقيق التخدير العميق والحفاظ عليه، يتم توصيل مسبار الـ optrode بمصدر الليزر. ثم يتم تسليط شعاع ليزر بطول موجي 530 نانومتر وبقدرة 15 ملي واط عبر الـ optrode المزروع لمدة تتراوح من خمس إلى ثماني دقائق لتحفيز نقص التروية البؤري.

لإجراء التحفيز البصري الوراثي، قم بتوصيل محفز الليزر بالقطب البصري (optrode). قم بتشغيل محفز الليزر البصري الوراثي بطول موجي 488 nanometer واضبطه على 10 milliwatts لمدة خمس دقائق لـ Opto-vTrap. وأخيرًا، ضع الفأر على وسادة تدفئة لاستعادة وعيه.

بالمقارنة مع خط الأساس، انخفض تدفق الدم الدماغي بعد التخثر الضوئي وظل مثبطاً بعد يوم واحد وسبعة أيام من السكتة الدماغية. وأظهرت قوة قبضة الطرف الأمامي انخفاضاً ملحوظاً للغاية بعد يوم واحد وظلت مثبطة بعد سبعة أيام من السكتة الدماغية. تم محاذاة عوابر الكالسيوم في الخلايا النجمية المسجلة بواسطة قياس الفلورية الليفية والنبضات العصبونية من الفسيولوجيا الكهربائية بناءً على الطوابع الزمنية.

بعد السكتة الدماغية الناجمة عن التجلط الضوئي، انخفضت معدلات إطلاق الإشارات بشكل ملحوظ في كل من العصبونات الهرمية والعصبونات البينية مقارنة بمعدل الإطلاق الأساسي أثناء مهمة قبض الطرف الأمامي. وفي الحالة الأساسية، بلغت التحولات الكلسية في الخلايا النجمية ذروتها خلال أربع إلى ست ثوانٍ من بدء المهمة. إلا أن السعة انخفضت بشكل ملحوظ بعد السكتة الدماغية الناجمة عن التجلط الضوئي، مما يعكس ضعف نشاط الكالسيوم.

أظهرت مخططات راستر (Raster plots) والمؤشرات الزمنية لتكرار النبضات المحيطة بالتنبيه (peri-stimulus time histograms) تغيرات في النشاط العصوني أثناء التنبيه البصري. وقد أظهرت معدلات إطلاق الخلايا العصبية الهرمية والخلايا العصبية البينية انخفاضاً ملحوظاً بعد التنبيه البصري مقارنة بخط الأساس قبل التنبيه، مما يؤكد أن تعديل الخلايا النجمية له تأثير ملموس على استثارة الدائرة المحلية. يسمح هذا البروتوكول بالتسجيل المستمر للتمرين والنشاط العصبي عبر الجدول الزمني للسكتة الدماغية الأمامية، بدءاً من مرحلة ظهور الأعراض الحادة وصولاً إلى المرحلة المزمنة.

يعتمد النجاح في هذا البروتوكول على المحاذاة الدقيقة أو المنسقة. يتطلب زرع ألياف البصريات أحادية العين فترات كافية للتعبير الفيروسي عبر العمليات الجراحية. يمكن للدراسات المستقبلية استخدام غرسات متعددة لمراقبة مناطق أوسع من الدماغ أو استهداف أنواع خلايا مختلفة باستخدام اختبارات سلوكية متنوعة.