نظام ميكروفلويديك لنمذجة خلل البطانة تحت إجهاد القص النابض الفسيولوجي وارتفاع السكر التذبذب

تبحث هذه الدراسة في كيفية تأثير ارتفاع سكر الدم التذب المتزامن وإجهاد القص النابض معا على خلل البطانة في أمراض الأوعية الدموية السكرية. النماذج الحالية تستخدم التدفق العالي للجلوكوز أو التدفق الطبقي الثابت للبدء بالأمام. نبحث في كيفية مواجهة إجهاد القص النابض لإصابة الجلوكوز المتذبذبة.

للبدء، استخدم برامج التصميم بمساعدة الحاسوب لتصميم هيكل الشريحة الميكروفلويدية. اصنع قالب SU-8 الرئيسي من خلال شركة تجارية. في كوب خلط نظيف، اخلط عامل معالجة بولي ديميثيل سيلوكسان مع ما قبل البوليمر بنسبة 10:1 حسب الوزن وتحرك الخليط يدويا بقوة لمدة خمس دقائق.

ثم ضع الحاوية في غرفة تفريغ بضغط 0.08 ميغاباسكال لمدة لا تقل عن 15 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء المحبوسة أثناء الخلط. صب البولي ديميثيل سيلوكسان على الويفر الموضوع في طبق بتري زجاجي. قم بإزالة الغاز، حيث صب البولي ديميثيل سيلوكسان على الرقائق في مجفف لمدة 15 دقيقة إضافية لإزالة أي فقاعات تتكون أثناء الصب.

ضع طبق بتري الذي يحتوي على القالب والبوليمر في فرن ساخن مضبوطا على 80 درجة مئوية لمدة ساعتين. باستخدام مشرط، قم بتقشير لوح البوليمر المتصلب من القالب الرئيسي بعناية. باستخدام أداة ثقب النواة، أنشئ منافذ دخول ومخرج عند نهايات القناة المحددة على لوح البوليمر.

نظف غطاء الزجاج والوجه المزخرف لبلطة البوليمر باستخدام شريط لاصق. بعد ذلك، عالج كل من لوح البوليمر وغطاء الزجاج بمنظف بلازما بقوة 65 واط تحت هواء الغرفة لمدة 60 ثانية. قم فورا بمحاذاة وجه قناة البوليمر مع الجانب المعالج من غطاء الزجاج.

ثم اضغط بلطف لتكوين قناة ميكروفلويدية مغلقة بشكل دائم. ضع الشريحة الميكروفلويدية الملتصقة في زجاجة زجاجية مثقلة بالبورون مملوءة بماء منزوع الأيونات. قم بالتعقيم بالتداخل عند 121 درجة مئوية و15 رطلا لكل بوصة مربعة لمدة 20 دقيقة.

ضع الشريحة المعقمة في طبق زراعة بحجم 60 ملم مملوء بخليط متساوي من PBS وDMEM منخفض الجلوكوز. ثم باستخدام حقنة بسعة ملليلتر واحد، أدخل 100 ميكروغرام لكل ملليلتر من الفيبرونكتين إلى القناة وحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات. بعد ذلك، أضف 24.5 ملليمولر ديمانيتول إلى DMEM منخفض الجلوكوز لرفع الضغط الأسموزي.

أضف خمسة ملليمولات D-جلوكوز إلى DMEM عالي الجلوكوز للحصول على تركيز نهائي 30 ملليمول. حضر زراعة الجلوكوز العادية متوسطة ومتوسطة ومتوسطة مع متوسط ومتوسط مع مكمل 20٪ FBS و1٪ بنسلين ستربتوميسين. ثم زيت PBS دافئ، التربسين، وسط زراعة الجلوكوز العادي، ووسط زراعة الجلوكوز العالي في حمام ماء عند 37 درجة مئوية.

احصد خلايا بطانة الوريد السري البشري من طبق الزراعة عند 90٪ من التقاء الجسم. افصل الخلايا باستخدام محلول تريبسين-EDTA بنسبة 0.25٪. بعد حضانة الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، عد الخلايا المحصودة وأعد تعليقها بشكل منفصل في وسط الجلوكوز الطبيعي وعالي الجلوكوز بتركيز 1 في 10 إلى قوة 6 خلايا لكل ملليلتر.

باستخدام حقنة بسعة ملليلتر واحد، قم بحقن 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في منفذ السحب من شريحة الميكروفلويديك مع وسط جلوكوز عادي للمجموعة الضابطة ووسط عالي الجلوكوز للمجموعة التجريبية. ضع رقائق الميكروفلويديك في حاضنة مرطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة. احسب معدل التدفق المطلوب لتحقيق إجهاد القص النابض المستهدف باستخدام المعادلة المعروضة.

وصل مصدر الضغط بوحدة التحكم في الضغط. ثم ربط وحدة التحكم بالضغط بوحدة التحكم في الصمامات المتصلة بالكمبيوتر للتحكم التلقائي في أشكال موجات الضغط. املأ خزانين بسعة 100 ملليلتر، أحدهما بوسط زراعة الجلوكوز العادي والآخر بوسط زراعة عالي الجلوكوز.

قم بتوصيل الخزانات بالقنوات المقابلة لمتحكم الضغط. ثم اربط الخزانات والصمام المغناطيسي ثلاثي الاتجاه ذو الوضعين باستخدام أنابيب سيليكون. حدد إجهاد القص الفسيولوجي النابض المستهدف لمعدل تدفق يقارب 200 ميكرولتر في الدقيقة.

برمج مضخة الهواء القابلة للبرمجة لتوليد دالة موجة جيبية للحفاظ على إجهاد القص النابض. بعد ذلك، برمج وحدة التحكم في الصمام لتبديل القنوات كل خمس دقائق لتوليد تذبذب جلوكوز بموجة مربعة أثناء التحفيز الديناميكي. اربط الصمام المغناطيسي ثلاثي الوضعيات وشريحة الميكروفلويدية باستخدام أنابيب سيليكون.

ثم قم بتشغيل نظام المضخة القابل للبرمجة لتجهيز الأنبوب. بعد ذلك، باستخدام موصلات الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 1.3 ملم بزاوية زاوية 90 درجة، قم بتثبيت منافذ المدخل والمخرج من شريحة الميكروفلويديك على الأنبوب. قم بتوصيل مخرج الشريحة الميكروفلويدية بخزان النفايات، ثم شغل المضخة مرة أخرى لتوفير إجهاد الجلوكوز المتذبذب والنابض المشترك لمدة 30 دقيقة إجمالا.

بعد إجراء التحقق من مجال التدفق، جهز محلول العمل للكالسين AM ويوديد البروبيديوم وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في نقطة التجربة النهائية. بعد شطف القناة مرة واحدة ب PBS، أدخل محلول العمل كالسين AM ويوديد البروبيديوم إلى القناة وحضن على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 30 دقيقة في الظلام. التقط فورا صورا فلورية للخلايا الملونة باستخدام مجهر فلوري مقلوب مزود بعدسة موضوعية بقوة 10 أضعاف.

التقط فورا صورا فلورية للخلايا الملونة باستخدام مجهر فلوري مقلوب مزود بعدسة موضوعية بزاوية 10x. استخدم فلتر فلوريساين إيزوثيوسيانات الأخضر للكالسيين AM ومرشح التتراميثيل رودامين أو الرودامين الأحمر ليوديد البروبيديوم. بعد غسل القناة ثلاث مرات باستخدام PBS، أدخل محلول المجس الفلوري التأكسدي الحي للخلايا في القناة واحتضنه كما أوضح سابقا.

قم بغسل القناة ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة المجس غير المرتبط. التقط الصور الفلورية فورا باستخدام مرشح الأحمر البعيد المثبت من خلال عدسة موضوعية 20x مع الحفاظ على نفس معايير التعريض عبر جميع المجموعات. افتح الصور المكتسبة من الكالسين AM الأخضر وصور يود البروبيديوم الحمراء في ImageJ.

قم بضبط العتبة يدويا لكل قناة لتمييز إشارات الفلورسنت عن الخلفية. استخدم عداد الخلايا لقياس الخلايا الفلورية، مع تعديل الحد الأدنى لحجم الخلية بناء على الملاحظات لتحديد عدد الخلايا الحية والميتة عبر عدة مجالات رؤية. احسب نسبة الخلايا الحية باستخدام برامج جداول البيانات لكل حالة تجريبية.

ثم تحسب المتوسط والانحراف المعياري عبر عدة مجالات رؤية باستخدام برامج التحليل الإحصائي لمقارنة المجموعات. اسحب الصورة المفضلة إلى ImageJ. اختر تحليل واختر تعيين المقياس لمعايرة حجم البكسل باستخدام بيانات المجهر.

ثم إزالة إشارة الخلفية غير المحددة الموحدة من الصورة بأكملها باستخدام دالة طرح الخلفية عن طريق اختيار عملية واختيار طرح الخلفية. بعد ذلك، اختر الصورة واختر تعديل متبوعا بالعتبة لضبط شريط العتبة يدويا وتعريف إشارة نوع الأكسجين التفاعلي داخل الخلية. حدد القياسات باختيار تحليل واختيار تعيين القياسات لتشمل المساحة ومتوسط القيمة الرمادية.

اختر تحليل وتحليل الجسيمات لتحديد الحد الأدنى لحجم الخلية بناء على أبعاد الخلية المرصودة وقياس متوسط شدة الإشارة المقسمة داخل عائد الاستثمار الأحادي الطبقة الخلوية. أبلغ عن مستوى أنواع الأكسجين التفاعلي لكل حالة تجريبية كمتوسط القيم المقاسة المستمدة من ثلاثة مجالات رؤية عشوائية على الأقل لكل شريحة. أدخل النتائج الكمية في برنامج تحليل البيانات ورسم الرسوم البيانية.

تحديد الدلالة الإحصائية بمقارنة المجموعات التجريبية مع مجموعة التحكم باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار توكي بعد الحدث بمستوى دلالة 0.05. استخدم البرنامج لإجراء التحليل وتوليد مخططات تحتوي على أشرطة خطأ تمثل الانحراف المعياري. أظهرت صور الفلورة التمثيلية نسبة عالية من الخلايا القابلة للحياة عبر جميع المجموعات مع ملاحظة موت خلاوي ضئيلة في مجموعتي الجلوكوز الطبيعي والجلوكوز الطبيعي مع إجهاد القص النابض، بينما أظهرت مجموعات الجلوكوز المتذبذب والجلوكوز المتذبذب مع إجهاد القص النابض زيادة واضحة في الخلايا الميتة.

أظهر التحليل الكمي أن التعرض للجلوكوز المتذبذب أدى إلى انخفاض كبير في قدرة الخلايا على الحياة مقارنة بمجموعة الضابطة، وزاد تطبيق إجهاد القص النابض تحت ظروف الجلوكوز المتذبذب بشكل ملحوظ من قابلية البقاء مقارنة بالجلوكوز التذبذب وحده. في ظروف الجلوكوز الطبيعية، كانت مستويات أنواع الأكسجين التفاعلي داخل الخلايا منخفضة وانخفضت أكثر بعد تطبيق إجهاد القص. بينما تسببت ظروف الجلوكوز التذبذبية في زيادة ملحوظة في شدة التألق الأحمر، مما يشير إلى ارتفاع أنواع الأكسجين التفاعلي.

تم تقليل الزيادة التذبذبية الناتجة عن الجلوكوز في أنواع الأكسجين التفاعلي داخل الخلايا بعد تطبيق إجهاد القص. كشفت التحليلات الكمية أن إجهاد القص قلل بشكل ملحوظ من مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية تحت ظروف الجلوكوز الطبيعية. على النقيض من ذلك، أدت حالات الجلوكوز التذبذبذي إلى زيادة كبيرة في مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية مقارنة بالجلوكوز الطبيعي.

علاوة على ذلك، قلل إجهاد القص بشكل كبير من مستويات أنواع الأكسجين التفاعلية، حتى في ظروف الجلوكوز المتذبذب. يتيح هذا البروتوكول قياس مستويات ROS وتوفر الخلايا لدراسة خلل البطانة تحت ارتفاع سكر الدم التذبذبيري والإجهاد القصي النابض. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء تحليل جزيئي مثل مسار NRF2 أو إشارات iNOS لإزالة العينات لآليات حماية البطانة.

يمكن للدراسة المستقبلية استخدام هذا النظام لاستكشاف المسارات الميكانيكية البيولوجية، ودمج هندسة التدفق المضطرب أو زراعة الخلايا العضلية الملساء.