أغسطس 4, 2026
هدف هذا البروتوكول هو تمكين قياس عمر الفلورة الكمي لمجسات ريبوغلو لسير عمل تصوير RNA القابل لإعادة الإنتاج في المختبر، وفي الخلايا الثديية الحية، وفي النماذج الخلوية ثلاثية الأبعاد. نحدد إعداد العينات، وتسليم المجسات، وجمع البيانات، وسير العمل التحليلي الكمي لاستخراج قياسات عمر الفلورة غير المتحيزة.
تركز أبحاثنا على تصور الحمض النووي الريبي في الخلايا الحية للتحقيق في الديناميكيات المكانية والزمانية للحمض النووي الريبي. تستخدم منصة Riboglow التصوير المجهري لعمر الحياة الفلوري الكمي في الأنظمة متعددة الخلايا التي يمكن تطبيقها على الأنظمة البيولوجية في الصحة والمرض. للبدء، احصل على عينات الحمض النووي الريبي أو الخلايا مع مجسات Riboglow المحملة بالخرز.
قم بتشغيل نظام المجهر الضوئي المناعي الليزري المقطعي متبوعًا بوحدة التحكم في المجهر. قم بتشغيل نظام التصوير المناعي لعمر الحياة الفلوري المستند إلى العد الفردي للفوتونات المتزامنة مع الزمن أو FLIM، بما في ذلك وحدة الجمع بالليزر، وكاشف المضاعف الضوئي، وموقت الأحداث. بعد فتح برنامج NIS لاكتساب الصور وتحليلها، ضمن نافذة الإعداد والتكوين، حدد AX مع PicoQuant.
بمجرد بدء تشغيل البرنامج، حدد AX FLIM و FCS. لإعداد المجهر لاكتساب بيانات عمر الحياة الفلوري، تأكد من تحديد Galvano في قسم AX pad. اضبط قيمة المتوسط على واحد ووقت الإقامة على اثنين.
في قسم طاقة الليزر، قم بخفض منزلقات الليزر الفردية إلى 3 إلى 4٪. اضبط منزلق الليزر الكل على واحد. بعد اختيار الهدف 20X، في إعدادات منطقة المسح، حدد 512 بـ 512 وقم بتشغيل الكاشفات. لتحديد مسار ملف البيانات، انتقل إلى أسفل قسم وحدة التحكم وحدد التكوين.
بعد النقر فوق علامة التبويب PicoQuant أو FLIM FCS، ضمن مسار مساحة العمل، حدد رمز المجلد على اليمين. في موقع التخزين، أنشئ مجلدًا جديدًا للتجارب لهذا اليوم وأغلق نافذة التكوين. بمجرد تحديد الوضع المباشر ويظهر نافذة اكتساب الصور، حدد الوضع المباشر مرة أخرى لإيقاف جمع الفوتونات.
لإعداد نوافذ جمع بيانات التصوير المناعي لعمر الحياة الفلوري أو FLIM، انقر بزر الماوس الأيمن على نافذة الصورة المباشرة وحدد البرنامج المساعد PicoQuant. قم بتمكين عرض منحنى الانخفاض، وعرض تتبع الوقت، وعرض إحصائيات FLIM. لإعداد ترتيب الليزر للتجربة الخلوية، انتقل إلى إعدادات التجربة في أعلى اليمين من الصفحة بجانب الليزر.
بعد النقر فوق إضافة بجوار صندوق الصبغة متعدد القنوات، أضف الأصبغة المطلوبة. حدد الوضع الاحترافي. اضبط تعيينات الكاشف لكل طيف انبعاث.
قم بتوجيه أطياف الإثارة والانبعاث المتداخلة إلى أجهزة كشف مختلفة. على اللوحة اليمنى، اضبط ترتيب المرور لتقليل التداخل بين الأصبغة ذات أطياف الإثارة والانبعاث المتداخلة. بعد حفظ وتسمية تكوين الليزر الجديد، حدد التكوين المحفوظ للتجربة.
انقر بزر الماوس الأيمن على نافذة الاكتساب المباشر. اختر عناصر التحكم في الاكتساب، ثم حدد XYZ نظرة عامة. قبل تحميل طبق زراعة الخلايا للتصوير لـ FLIM، أضف صبغة النواة الخلوية الحية واخلطها جيدًا عن طريق الدوران بلطف على المنضدة وتركها جانبًا لمدة 30 ثانية.
ضع طبق التصوير على مرحلة المجهر. ادفع الطبق نحو الزاوية اليسرى السفلى من مرحلة المجهر. قم بلصق العينة بالمرحلة عند استخدام أهداف غير الهوائية لمنع الانحراف XY.
قم بالتبديل إلى قناة 4'6-Diamidino-2-phenylindole أو DAPI. استخدم مقبض التحكم حتى تصبح نوى الخلايا مرئية. إذا لزم الأمر، اضبط حساسية مقبض ارتفاع Z، وإذا لم تظهر الخلايا في المنظر، اضبط إحداثيات XY.
لتمكين نظام التركيز المثالي أو التركيز التلقائي PFS، على الجانب الأيمن من لوحة AX، حدد رمز العدسة المكبرة المجاور لزر PFS. بمجرد تطبيع المجهر تلقائيًا لارتفاع Z، تأكد من أن زر PFS يضيء ويظهر في التركيز. باستخدام كاشف AX، ابحث عن الخلايا المطلوبة باستخدام قناة DAPI.
ثم قم بالتبديل إلى قناة ATO 590 لتحديد الخلايا المحملة بالخرز بشكل فعال. بمجرد تحديد الخلية وتمركزها بالنقر المزدوج، قم بالتبديل إلى AX FLIM و FCS. تأكد من أن 512 بـ 512 محدد، اضبط حجم الإطار عن طريق النقر والسحب على الزوايا لتناسب الخلية.
اترك الإطار المعاد ضبط حجمه ليتحول إلى اللون الأحمر. انقر بزر الماوس الأيمن داخل الإطار أو حدد الوضع المباشر حتى يتحول الإطار إلى اللون الأخضر لتأكيد التعديل. بعد ضبط عدد اللقطات إلى القيمة المطلوبة، حدد التقاط.
راقب نافذة التقاط جديدة وصندوق تقدم التقاط على الجانب الأيمن من الشاشة. بمجرد فتح برنامج تحليل FLIM، انتقل إلى مسار الملف الصحيح. راقب عمليات الاكتساب التي تظهر تلقائيًا في نافذة برنامج التحليل.
أعد تسمية عمليات الاكتساب أثناء جمعها. عند اكتمال التقاط، قم بالتبديل مرة أخرى إلى كاشف AX. حدد الوضع المباشر للبحث عن خلية جديدة.
قم بضبط حجم نافذة AX FLIM وعلم الارتباط الفلوري أو FCS حسب الحاجة للخلايا الأكبر أو الأصغر. بعد الحصول على خلايا جديدة خلال فترة التصوير لمدة ثلاث ساعات، قم بتصدير ملف sptw الذي تم إنشاؤه. استمر في معالجة بيانات FLIM وتحليلها لاستخراج قياسات عمر الحياة الفلوري من العينات التي تم جمعها.
أظهرت منحنيات الانخفاض التمثيلية أن وجود علامة RNA A زادت من عمر الحياة الفلوري المستخرج في المختبر، بينما أظهرت العينات بدون علامة RNA A منحنيات انخفاض مائلة إلى اليسار، مما يشير إلى قيم متوسط عمر الحياة الأقصر. كانت فترات عمر الحياة الفلوري الخلوية للخلايا المحملة بالخرز مع 3xGly أقل بكثير من تلك المحملة بـ 5xGly. أظهرت منحنيات الانخفاض التمثيلية أن الخلايا المحملة بـ 3xGly كان لها منحنيات انخفاض مائلة إلى اليسار مقارنة بالخلايا المحملة بـ 5xGly، مما يشير إلى قيم متوسط عمر الحياة الفلوري الأدنى.
أظهرت نواة الخلايا المحملة بمجس Riboglow باستمرار فترات عمر حياة فلورية أعلى من العصارة الخلوية لنفس الخلية. أظهرت نافذة اكتساب المقياس الزائف للألوان، ومنحنيات الانخفاض، وقيم متوسط سعة tau المستخرجة نفس اتجاه عمر الحياة الفلوري. يسمح هذا البروتوكول للباحثين بتحديد عمر الحياة الفلوري للجزيئات الفلورية في سياقات بيولوجية مختلفة.
يمكن للباحثين إجراء تحليل كمي للبيانات وتقييم المتغيرات ذات الاهتمام باتباع هذه الإجراء، بما في ذلك إضافة روابط الحمض النووي الريبي. يمكن للدراسات المستقبلية تطبيق Riboglow FLIM على نماذج الأمراض، وتوسيع إمكانيات التعددية، وتتبع الديناميكيات الحمض النووي الريبي في أنظمة الحيوانات الحية.
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً مفصلاً لتقنية Riboglow-FLIM، وهي نظام مستشعرات حيوية للـ RNA مشفرة جينياً تتيح التصوير الكمي لجزيئات الـ RNA في خلايا الثدييات الحية باستخدام مجهر التصوير بمدى عمر الفلورسنت (FLIM). ويشمل سير العمل تحضير العينات، واكتساب الصور، والتحليل الكمي، مما يسهل دراسة ديناميكيات الـ RNA وتفاعلاته في كل من البيئات الخاضعة للتحكم وبيئات الخلايا الحية.
يُمثل التصوير الكمي لـ RNA في الخلايا الثديية الحية تحدياً بالغ الأهمية في المراحل المبكرة من اكتشاف الأدوية، لا سيما لفهم ديناميكيات RNA غير المشفر وآليات التنظيم. يتيح سير عمل Riboglow-FLIM قياساً قوياً وقابلاً للتكرار لتمركز RNA وتفاعلاته في البيئات الخلوية المعقدة، مما يدعم الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف وتقليل المخاطر الميكانيكية. وتعزز هذه القدرة الاستمرارية الترجمية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى الأبحاث قبل السريرية من خلال توفير بيانات كمية لـ RNA ذات دقة مكانية.
يدمج بروتوكول Riboglow-FLIM في التسلسل الممتد من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى الدراسات قبل السريرية، وذلك من خلال تمكين التصوير الكمي للـ RNA بدءاً من التحقق المختبري (in vitro) وصولاً إلى تحليل الخلايا الحية والنماذج ثلاثية الأبعاد.