اختبار حماية الأميكاسين لقياس وتصور غزو خلايا الإشريكية القولونية

نركز على توصيف كيفية غزو الإشريكية القولونية الغازية الملتصقة بخلايا الظهارة المعوية وتحديد العوامل البكتيرية التي تساهم في هذه العملية. العزلات المقاومة للجنتامايسين تحد من اختبارات الغزو التقليدية. يتيح هذا البروتوكول القائم على الأميكاسين قياس دقيق للبكتيريا داخل الخلية.

للبدء، اجمع جميع المواد والمواد اللازمة لاختبار الغزو. بعد ذلك، استرجع مخزون الجلسرون المجمد من سلالة الإشاريسيا كولي الغازية الملتصقة (AIEC) من فريزر 80 درجة مئوية. باستخدام عصا خشبية معقمة أو رأس ماصة، قم بكشط البكتيريا من الساق بلطف ووضعها على صفيحة لوريا-بيرتاني، أو LB، للحصول على مستعمرات فردية.

حضن الطبق عند 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي، باستخدام عصا خشبية معقمة أو رأس ماصة، اختر مستعمرة واحدة من لوحة المثقب. قم بتحصيح المستعمرة ب 3 ملليلتر من مرق LB وحضن الثقافة عند 37 درجة مئوية بسرعة 200 دورة في الدقيقة طوال الليل.

ثم قم بتخفيف من 1 إلى 10 لثقافة الزراعة الليلية في 1 ملليلتر من مرق LB. قس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر من الثقافة المخففة باستخدام مقياس طياف فوتوميتر. انقل 100 ميكرولتر من الزراعة الليلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر وجهاز طرد مركزي عند 6,000 جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.

استنشق المادة الفائقة بعناية دون إزعاج حبيبات الخلية وأعد تعليقها في 1 ملليلتر من السيروم ووسط خال من المضادات الحيوية والمضادات الحيوية. حساب الحجم المطلوب من تعليق البكتيريا لتحقيق تعدد العدوى أو MOI بقيمة 10 باستخدام الصيغة المرفقة. لتحضير وسط العدوى، انقل الحجم المحسوب من تعليق البكتيريا إلى أنبوب عقيم للطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 ملليتر وقم بزيادة الحجم إلى 1 ملليلتر باستخدام المصل ووسط خال من المضادات الحيوية والمضادات الفطرية.

اخلط بلطف عن طريق الرش صعودا وهبوطا عدة مرات. جهز صفيحة بسعة 96 بئر لتحديد وحدات تكوين المستعمرة لكل ملليلتر من الزراعة البكتيرية المخففة ليلا عن طريق إجراء تخفيفات متسلسلة عشرة أضعاف في PBS معقم 1X. انقل 200 ميكرولتر من الثقافة المخففة طوال الليل إلى البئر الأول في الطبق.

انقل 20 ميكرولتر من الزراعة إلى الصف التالي تحتوي على 180 ميكرولتر من 1X PBS. اخلط بعمل الأنابيب لأعلى وأسفل 10 مرات وكرر عملية التخفيف حتى تصل إلى 10 إلى قوة 6 باستخدام رأس ماصة جديد في كل مرة. الآن ضع 10 ميكرولتر من التخفيف النقطي على شكل ثلاث نسخ من 10 إلى قوة من 2 إلى 10 إلى قوة 6 تخفيفات على ألواح LB مثقاب.

دع البقع تمتص داخل الحفر بالقرب من اللهب. حضن الصفائح طوال الليل عند درجة حرارة تتراوح بين 27 إلى 30 درجة مئوية لمنع نمو المستعمرات والحصول على مستعمرات فردية واضحة. قم بإزالة طبقات الخلايا الظهارية السليمة المتصاعدة من Caco-2 التي تم زراعتها في لوحة زراعة مغطاة بالكولاجين مكونة من 24 بئرا من الحاضنة واسحب الوسط الكامل من كل بئر.

نحط ملليتر واحد من المصل ووسط خال من المضادات الحيوية والمضادات الفطرية في كل بئر. استنشق الوسائط لإزالة آثار الوسائط وكرر الغسيل مرة أخرى ليصبح المجموع غسلتين. الآن أضف 1 ملليلتر من وسط العدوى المعد مسبقا يحتوي على AIEC في كل بئر من صفيحة 24 بئر تحتوي على خلايا Caco-2.

قم بطرد المركزي بلوحة 24 بئر بحرارة 500 جرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمزامنة الاتصال البكتيري مع الطبقة الظهارية الأحادية وحضانة الصفيحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات للسماح بحدوث غزو بكتيريا. تحضير وسط يحتوي على مضادات حيوية بإضافة 240 ميكروغرام لكل ملليلتر من الأميكاسين إلى وسط مصل مسخن مسبقا ووسط خال من مضادات حيوية-مضادات فطرية. بعد فترة العدوى، استنشق الوسط من طبقات خلايا Caco-2 الأحادية وغسل كل بئر بملليتر واحد من المصل ووسط خال من المضادات الحيوية والمضادات الفطرية.

استنشق الوسائط وكرر الغسيل مرة أخرى ليصبح المجموع غسلتين. ثم تضع ماصة ملليتر واحد من 240 ميكروغرام لكل ملليلتر تحتوي على وسط أميكاسين في كل بئر. بالتوازي، عالج مجموعة أخرى من الخلايا ب 100 ميكروغرام لكل ملليلتر جنتاميسين للمقارنة، وحضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة للقضاء على البكتيريا خارج الخلية.

بعد الحضانة، استنشق الوسائط من كل بئر. أضف 1 ملليلتر من PBS لغسل البكتيريا الملتصقة. قم بسحب PBS وكرر الغسيل مرة أخرى ليصبح المجموع غسلتين.

الآن أضف 200 ميكرولتر من 1٪ Triton X100 مخفف في PBS إلى كل بئر وحضن على هزاز مداري بسرعة 90 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق لتحليل الخلايا الظهارية. يتم رفع وأسفل حوالي 30 مرة في كل بئر لفصل الخلايا عن اللوحة. بعد ذلك، قم بتخفيف تسلسلي عشرة أضعاف لمحللات الخلايا في صفيحة بسعة 96 بئر باستخدام PBS.

طبق 10 ميكرولتر من التخفيف النقطي بثلاث نسخ من غير مخفف إلى 10 إلى قوة 3 تخفيفات على ألواح LB مثقاب. بعد أن تجف البقع، حضن الألواح طوال الليل عند درجة حرارة تتراوح بين 27 إلى 30 درجة مئوية للحصول على مستعمرات فردية واضحة. بعد الحضانة، قم بإزالة الصفائح وعد المستعمرات المعزولة جيدا من التخفيفات النقطية المناسبة التي تحتوي على أكثر من سبع مستعمرات في كل بقعة عبر الثلاثيات.

وأخيرا، حساب اللقاح واسترجاع وحدات تكوين المستعمرة لكل ملليلتر ونسبة الغزو باستخدام المعادلات. أدى العلاج إما بالجينتاميسين أو الأميكاسين بعد إصابة طبقات خلايا Caco-2 الأحادية بسلالة AIEC الغازية NRG857c، أو سلالة التحكم غير الغازية Escherichia coli DH5 alpha إلى ملفات غزو مماثلة. أشارت هذه النتائج إلى أن الأميكاسين كان فعالا مثل الجنتاميسين في القضاء على البكتيريا خارج الخلية ويعكس بدقة عبء البكتيريا داخل الخلية.

أدى علاج عزلات الإشريكية القولونية المقاومة للجنتاميسين التي تم الحصول عليها من مرضى مرض الأمعاء الالتهابي باستخدام جينتاميسين إلى قيم تعافي بكتيرية متباينة للغاية تتراوح بين 21 إلى 2,788٪. على النقيض من ذلك، قلل علاج الأميكاسين بشكل كبير من تعافي البكتيريا عبر جميع العزلات، مما أظهر فعاليته ومكن من قياسات غزو أكثر موثوقية. يتيح هذا البروتوكول القياس الدقيق للبكتيريا داخل الخلايا وتقييم غزو البكتيريا في الخلايا الظهارية. يمكن استخدام طرق إضافية مثل المجهر المناعي الفلوري لمزيد من التحقق من صحة غزو البكتيريا والتحقق من تحديد الموقع داخل الخلايا.

يمكن للدراسات المستقبلية تحديد عوامل الضراوة الجديدة والتحقيق في مسارات المضيف التي تستهدف أثناء عدوى الإشريكية القولونية الغازية الملتصقة.