التموقع المناعي ثلاثي الأبعاد في خلايا الذرة الانقسام

يركز بحثنا على تطوير نهج ثلاثي الأبعاد لدراسة الخلايا النطفية الذكرية في الذرة وتصور البروتينات الميوزية في الخلايا المفردة. وبالإضافة إلى الذرة، يمكن تطبيق هذا البروتوكول لدراسة الخلايا النطفية في الأرز والشيلم والشعير والقمح. للبدء، يتم الحصول على نباتات ذرة في مرحلة V13 مع بقاء النورات الزهرية نامية داخل الساق.

خلال أسبوع تثبيت المتوك في المرحلة الانقسامية، اضغط برفق على الساق المتضخمة عند النتوء مع ارتداء القفازات للتحقق مما إذا كانت لينة بما يكفي لقصها وفتحها. بعد تحضير المحاليل المنظمة المطلوبة، جهز غرفة رطوبة عن طريق وضع خمس إلى 10 مناشف ورقية مبللة داخل صندوق بلاستيكي، ثم تخلص من الماء الزائد في الغرفة.

باستخدام شفرة حلاقة، اقطع الساق عند مستوى النورة للكشف عن فروع السنبلة والفروع الجانبية. بعد تشريح وجمع الفروع الجانبية، لفها في مناشف غرفة الترطيب مع الحفاظ على الغرفة في درجة حرارة الغرفة. باستخدام مجهر ستيريو، اجمع المتوك الطازجة من الأزهار الصغيرة في طبق بتري بقطر 35 millimeter يحتوي على 2 milliliters من one Xbuffer A أو BA. حدد مراحل الانقسام الاختزالي بناءً على الحجم واللون.

بعد نقل المتوك إلى طبق بتري جديد بقطر 35 مليمتر، أضف 3 مل من محلول التثبيت إلى المتوك. أحكم إغلاق طبق بتري باستخدام شريط البارافيلم لمنع تبخر الفورمالديهايد. ضع طبق بتري قطر 35 مليمتر فوق طبق بتري أكبر حجماً مثبت على هزاز دوراني، واضبط السرعة من 40 إلى 60 RPM في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.

اشطف المتوك باستخدام ثلاثة مليلتر من 1 XBA. بعد نقل المتوك إلى أطباق بتري صغيرة، أحكم إغلاق أطباق بتري وضعها على هزاز دوراني في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة مع ضبط السرعة من 40 إلى 60 RPM. وباستخدام ملقط نظيف، انقل المتوك إلى طبق بتري صغير بقطر 35 مليمتر يحتوي على ثلاثة مليلتر من 1 XBA.

بمجرد إغلاق طبق بتري بإحكام باستخدام البارافيلم، ضع طبق بتري الصغير داخل طبق بتري أكبر. بعد تغطيته بورق الألمنيوم، خزن العينة عند درجة حرارة 4 °C حتى وقت الاستخدام. في اليوم الأول، حضّر 2 mL من محلول الأكريلاميد عن طريق خلط أحجام متساوية من الأكريلاميد و 2XBA.

قم بإزالة الغازات من محلول الأكريلاميد تحت التفريغ لمدة تتراوح من خمس إلى 10 دقائق قبل إضافة كبريتيت الصوديوم وبيرسلفات الأمونيوم. قم بتوزيع 100 µL من خليط الأكريلاميد و 2 XBA بنسبة واحد إلى واحد في أنابيب سعة 1.5 mL وفقاً لعدد الشرائح المُعدة. ضع قطعاً من البارافيلم بحجم 2 سم في 2 سم فوق طبق بتري وضعها تحت مجهر تشريحي ستيريوسكوبي.

بعد قص طرف الماصة باستخدام المقص، اسحب 50 µL من محلول BA مع المتك ووضعها على شريط البارافيلم. ثم اسحب 25 µL من محلول BA وضعها في منطقة أخرى من شريط البارافيلم. بعد تثبيت المتك باستخدام الملقط، قم بقص أطرافها باستخدام المشرط.

بمجرد عصر الخلايا المنصفة، استخدم ماصة لنقلها إلى قطرة من محلول BA بحجم 25 µL وامزجها برفق. ثم اسحب ماصة بحجم 10 µL من خليط الخلايا المنصفة وضعها على غطاء شريحة منفصل. أضف بسرعة 5 µL من كبريتيت الصوديوم و 5 µL من بيرسلفات الأمونيوم إلى أنبوب سعة 1.5 mL يحتوي على الأكريلاميد و 2X BA.

قم بنقل 5 µL من هذا المزيج باستخدام الماصة إلى غطاء الشريحة واخلطه مع الخلايا الميوزية. ضع غطاء شريحة مطلياً بالبولي-لايسين في الأعلى بزاوية 45 درجة. بعد الانتظار لمدة تتراوح من 30 إلى 50 دقيقة لإتمام عملية البلمرة في درجة حرارة الغرفة، قم بفصل أغطية الشرائح بعناية باستخدام شفرة حلاقة.

بعد ذلك، ضعها في طبق بتري بحيث تكون جهة الوسادة للأعلى. اشطف شريحة الغطاء باستخدام 1 ml من 1XPBS المضاف إليه 1 mM من حمض إيثيلين ثنائي الأمين رباعي الخليك (ethylenediaminetetraacetic acid)، أو EDTA، و1% Triton في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. قم بتحضير ودمج الأجسام المضادة الأولية من أنواع مضيفة مختلفة لضمان الحصول على إشارات متميزة أثناء الكشف.

أضف 50 µL من الأجسام المضادة الأولية المخففة إلى مركز الشريحة الغطائية التي تحتوي على الوسادة. بعد ذلك، ضع طبق بتري في غرفة رطبة طوال الليل. وفي اليوم الثاني، قم بتحضير 500 mL من محلول الغسيل الذي يحتوي على 1x PBS و0.1% Tween 20 و1 mM EDTA.

باستخدام الماصة، قم بإزالة المحلول الذي تم تحضينه طوال الليل. اغسل شريحة الغطاء مرتين باستخدام 1 mL من محلول الغسيل المنظم. بعد إزالة المحلول المنظم، أضف مرة أخرى 1 mL من محلول الغسيل المنظم واتركه للتحضين لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

كرر خطوة الغسيل هذه سبع مرات إضافية. بعد الغسيل النهائي، غطِّ الطبق واتركه طوال الليل في غرفة رطبة. قم بتحضير الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تخفيفها بنسبة 1 إلى 50 في محلول الحجب.

بعد إزالة محلول الغسيل، أضف 50 µL من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى مركز كل منصة. ثم، ضع طبق بيتري في غرفة رطبة لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المحلول من البئر، اغسله أربع مرات باستخدام 1 mL من منظم الغسيل لمدة ساعة واحدة لكل مرة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل البئر بـ 1 mL من PBS لمدة 10 دقائق وكرر هذه العملية مرتين إضافيتين. أضف 500 µL من DAPI، المحضر بتركيز نهائي قدره 1 µg/mL إلى البئر، ثم حضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد إخراج الذهب المطول من درجة حرارة 4 °C، اتركه يذوب حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة.

اغسل الشرائح باستخدام 1 mL من PBS لمدة 30 دقيقة وكرر العملية مرتين. بعد إزالة محلول الغسيل النهائي، أضف قطرتين من prolonged antifade في منتصف الوسادة. وبمجرد رفع غطاء الشريحة من البئر، ثبته على الشرائح المحددة.

باستخدام جهاز شفط، قم بإزالة الجلسرين الزائد من حواف شريحة التغطية ثم أحكم إغلاقها بطبقتين من طلاء الأظافر. افحص الشرائح تحت المجهر باستخدام أطوال موجية وفلاتر استثارة مناسبة لالتقاط الصور. أظهر صبغ DAPI نواة واضحة وصبغاً للكروماتين، بالإضافة إلى صبغ سيتوبلازمي أصلي أكثر خفوتاً للحمض النووي البلاستيدي والميتوكوندري.

غياب البروتين AFD1 (Absence of first division one)، والبروتين ASY1 (asynaptic one)، والبروتين ZYP1 (Zipper1) من الكروموسومات وفي السيتوبلازم خلال مرحلة ما قبل الليبتينيم (preleptinema). وفي المراحل اللاحقة، تركزت الإشارة على الكروموسوم، بينما ظل جزء كبير من ZYP1 في السيتوبلازم قبل حدوث التشابك الكامل. أما بروتين التماسك الميوزي AFD1 فقد شكل بنية خطية فقط بعد مرحلة الزيجونيم (zygonema).

بالتزامن مع تكوين الخيوط الخطية للمعقد التشابكي. أصبحت إشارة ASY1 باهتة نسبياً بعد تحميل ZYP1 وAFD1 في البنى الخطية. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة التموضع المشترك للبروتينات وديناميكيتها، والتموضع الطبيعي داخل الخلايا، والبنية الصبغية ثلاثية الأبعاد، والتقدم الانقسامي الاختزالي، وتحديد المراحل.

يتمثل التحدي الرئيسي في هذا البروتوكول في الاختيار الدقيق لمجموعات متوافقة من الأجسام المضادة الأولية والثانوية. ويمكن بناء الدراسات على هذا العمل من خلال مقارنة الانقسام الاختزالي لدى الذكور والإناث للتحقيق في الآلية الجزيئية الكامنة وراء athelchasmi.