التصوير الكمي للخلية الحية لشكل النواة وديناميكيات الكروماتين أثناء التطور والإجهاد البيئي في جذر الأرابيدوبسيس ثاليانا

تبحث أبحاثنا في الجينات والآليات التي تمكن التعافي طويل الأمد من الجذور من الإجهاد الأسموزي لتقوية المحاصيل ضد الجفاف. على الرغم من تطويره لجذور الأرابيدوبسيس، يمكن تكييف هذا البروتوكول مع أنظمة تحتوي على خطوط علامات بروتينية فلورية. احصل على ألواح النمو التي تحتوي على شتلات الأرابيدوبسيس ثاليانا المحضرة للتصوير.

بيبت 60 ميكرولتر من الماء النقي على شريحة زجاجية. ضع ثلاث جذور شتلة A.thaliana عمرها ستة أيام في الماء. ضع غطاء بحجم 22x22 ملم بحجم 1.5 فوق الجذور دون تغطية الأوراق.

في إعدادات المجهر الكونفوكلي، اضبط وقت تعريض الليزر إلى 1,000 مللي ثانية. في إعدادات دمج الليزر، اضبط ليزر 488 نانومتر على 50٪ للتصوير البروتيني الفلوري الأخضر (GFP). اضبط ليزر 561 نانومتر على 50٪ للتصوير بالبروتين الفلوري الأحمر، أو RFP.

صور العينة باستخدام عدسة 20X بدون تكبير بصري. اضبط حجم خطوة شريحة Z إلى 0.3 ميكرومتر. اضبط فترة التصوير إلى دقيقة واحدة، ومدة التصوير الإجمالية إلى 10 دقائق.

حدد موقع الجذور واختر حتى 20 شريحة Z. التقاط صور 16-بت. ابدأ اكتساب الفاصل الزمني واحفظ الفاصل الزمني كملف TIFF باستخدام الضغط بدون فقدان.

انقل البيانات التي تم الحصول عليها إلى الحاسوب للتحليل. افتح برنامج ImageJ أو Fiji. انقر واسحب ملف VSI إلى نافذة تطبيق ImageJ الرئيسية أو نافذة تطبيق فيجي.

في موجه خيارات استيراد تنسيقات Bio، اضغط على موافق في أسفل اليمين. ثم في ملف خيارات السلسلة بصيغة Bio، تأكد من اختيار السلسلة الأولى. اضغط على موافق في أسفل اليسار.

بمجرد تحميل الصورة، قسم الإشارات باختيار الصورة. اختر اللون واختر تقسيم القنوات. عرض النوافذ المنفصلة التي تم إنشاؤها للنوى الموسومة ب GFP والكروماتين الموسوم ب RFP.

حدد أي من النافذتين الصورتيتين يتوافق مع الكروماتين. بعد النقر على نافذة صورة الكروماتين، قم بتطبيق عملية مشروع Z باختيار Image، واختيار Stacks، ثم النقر على Z Project من نافذة ImageJ الرئيسية. غير نوع الإسقاط إلى أقصى شدة.

تأكد من تفعيل All Time Frames، واضغط على موافق لتوليد الإسقاط. افتح قائمة التباين بالضغط على زر التحكم في Shift C، أو باختيار Image واختيار Adjust، ثم النقر على سطوع أو تباين من نافذة ImageJ الرئيسية. حرك شريط الحد الأدنى إلى اليسار حتى يصبح الكروماتين واضحا.

انتقل إلى الإضافات. انقر على السهم الأسفل في قائمة الإضافات للتمرير إلى خيار التتبع. اختر التتبع واضغط على TrackMate.

تأكد من دقة إعدادات المعايرة واضغط التالي. اختر كاشف العتبة واضغط التالي. انتقل إلى الإطار الأخير من الفاصل الزمني في نافذة الصورة.

اضغط على تلقائي بجانب عتبة الشدة ثم اضغط على المعاينة. قم بضبط عتبة الشدة واضغط على المعاينة. كرر عملية التعديل والمعاينة حتى يتم إضافة الكروماتين بالكامل مع أقل ضوضاء، ثم اضغط التالي.

اسمح لاكتشاف العتبة الأولي بالإكمال، ثم اضغط على التالي. قم بضبط العتبة يدويا حتى يظهر الكروماتين فقط، ثم اضغط على التالي. ضبط عرض صورة الفلورة واضغط التالي.

اختر متتبع LAP البسيط واضغط التالي. اضبط أقصى مسافة ربط إلى 5 ميكرون، وأقصى مسافة إغلاق الفجوة إلى 15 ميكرون، وإغلاق الفجوة على 1، ثم اضغط التالي. اسمح بإكمال التتبع.

راقب المسارات المعروضة في نافذة الصورة الأصلية واضغط على التالي. اضغط على زر الزر الأخضر زائد في الزاوية السفلية اليسرى لإنشاء فلتر. اختر عدد الأماكن في وضع الحلبة.

اضبط شريط العتبة. تأكد من أن وضع الفلتر مضبوط على Above، ثم اضغط التالي. انقر على زر المسارات في أسفل صفحة خيارات العرض.

اختر تصدير إلى CSV. تجاهل صفحة الرسم المدمجة واضغط على التالي. راجع نتائج تحليل TrackMate.

انقر على Capture Overlay ثم اختر التنفيذ. احفظ الفيديو باختيار ملف والنقر على حفظ ك، ثم اختيار صورة GIF. بدت خلايا الجذور المعالجة بالملح مجهدة، وظهرت بؤر المركز المركزية أكبر من الظروف الضابطة.

كانت سرعة الكروماتين أعلى بشكل ملحوظ في ظروف التحكم مقارنة بظروف معالجة بكلوريد الصوديوم بحجم 100 ملليمول. يتيح هذا البروتوكول تتبع وقياس حركة البروتينات الموسومة بالفلورية عبر الزمن في جذور الأرابيدوبسيس. التحدي الأهم في هذا البروتوكول هو الحصول على صور عالية الجودة، حيث يمكن أن يجعل التبييض الفوتوغرافي وانحراف العينات تتبع اللعبة أمرا صعبا.

من المتوقع أن تبحث الدراسات المستقبلية في الآليات الكامنة وراء انخفاض حركة الكروماتين التي لوحظت في دراستنا.