التوصيف الوظيفي للشركاء الفرديين قبل وما بعد المشبك في الجهاز العصبي المركزي ليرقات ذبابة الفاكهة باستخدام CaMPARI
June 16th, 2026
يقيم هذا البروتوكول النشاط المشبكي الوظيفي بين الشركاء العصبيين المحدد في الجسم الحي في الجهاز العصبي المركزي ليرقات ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر باستخدام أدوات مشفرة وراثيا. تحفيز البصريات البصرية التي يوساها CsChrimson للخلايا العصبية الحسية قبل المشبكية cIVda يحفز التحويل الضوئي المعتمد على الكالسيوم لكامباري في الخلايا العصبية الداخلية بعد المشبكية في الحوض-4.
تركز أبحاثنا على تقييم الاتصال التشابكي الوظيفي بين شركائنا المحددين للعصبونات في يرقات الذبابة البيضاء الحية والمحللة. تتطلب الطرق التقليدية التشريح أو التحفيز المادي. يستخدم هذا البروتوكول علم التخليق الضوئي في اليرقات السليمة، مما يقلل من الارتباكات.
للبدء، قم بإذابة وسط جل الذرّة في الميكروويف لمدة 8-10 ثوانٍ دون غليه واتركه ليبرد في درجة حرارة الغرفة دون أن يتصلب. قبل التبريد الكامل، أضف all-trans-retinal، أو ATR، بتركيز 0.5 مللي مولار لتكملة الوسط للذباب الذي يحتاج لتفعيل csChrimson. قم بتغطية القوارير تمامًا بورق الألمنيوم لمنع تعرضها للضوء.
قم بعبور الإناث البكر الحاملة لجين CaMPARI و csChrimson مع الذكور الحاملة لجين GAL4 وLexA في قوارير بلاستيكية تحتوي على الوسط المُعد. قم بإعداد قوارير موازية بدون ATR كضوابط. قم بحضانة القوارير عند درجة حرارة 25 درجة مئوية حتى تصل اليرقات إلى المرحلة الثالثة.
استخدم فرشاة لجمع يرقة من المرحلة الثالثة. قم بشطف اليرقة في لوحة صغيرة ثلاثية الشقوق تحتوي على 0.1 مولار من PBS لإزالة أي طعام متمسك بها. ضع كمية صغيرة من طين النمذجة في كل زاوية من زوايا شريحة تغطية نظيفة مقاس 18 × 18 ملليمترًا.
ضع اليرقة في قطرة من PBS على الشريحة وقم بتوجيهها بحيث يكون الجانب البطني للأسفل. قم بوضع شريحة نظيفة تحت الشريحة التي تحتوي على اليرقة. قم بتثبيت الشريحة بتطبيق طين النمذجة على الزوايا، باستخدام قدر كافي من الضغط لتثبيت اليرقة دون سحقها أو كسر الزجاج.
قم بوضع الشريحة التي تحتوي على اليرقة على منصة المجهر الكونفوكالي المجهزة بعدسة 40x/1.2. في واجهة برنامج المجهر، انقر على Live. ثم ضمن لوحة Z Stack، انقر على Set First ثم Set Last متبوعًا بـ Stop للحصول على مجموعة أساسية Z Stack من الخلايا العصبية ما بعد التشابكية التي تعبر عن CaMPARI.
ضمن قائمة Channels، قم بتعيين قناة خضراء 488 نانومتر بقدرة ليزر 0.8٪. بعد ذلك، قم بتعيين قناة حمراء 561 نانومتر بقدرة ليزر 0.8٪. ضمن قائمة Z Stack، قم بتعيين قيمة الفاصل إلى 1 ميكرومتر.
في قائمة Acquisition، اختر Presets لتعيين دقة 256 × 256 بكسل. قيمة Line Averaging 2، والمسح الثنائي الاتجاه وسرعة المسح 9، مما يسمح بالتحديث التلقائي لوقت البكسل. قم بإجراء جميع التصوير في بيئة مظلمة، مع الحفاظ على معلمات الحصول على بيانات متطابقة طوال التجربة.
قم بتعيين ضوء التحويل الضوئي 405 نانومتر بقدرة ليزر 0.5٪. وضوء التحفيز الضوئي البصري 561 نانومتر بقدرة ليزر 0.8٪. انقر على Live، ثم حدد Best Fit ضمن لوحة Histogram.
اترك كلا الليزر لتحفيز اليرقة في وقت واحد لمدة 30 ثانية، ثم قم بإيقاف التحفيز. أثناء الحصول على ZStack بعد التحفيز باستخدام نفس المعلمات كقاعدة، قم بملاحظة التألق الأحمر لـ CaMPARI في الخلايا العصبية التي تم تحفيزها بالليزر من اليرقات التي تم تغذيتها بـ ATR والضوابط مع تحويل ضوئي ضئيل. في برنامج Fiji ImageJ، انقر على File، ثم اختر Open.
في نافذة خيارات استيراد BioFormats مع الإعدادات الافتراضية، انقر على OK لفتح صورة ZStack المكتسبة. ضمن قائمة Image، اختر Color ثم Split Channels لعرض القنوات الحمراء والخضراء للصورة المكتسبة. لطرح الخلفية، انقر على Process، ثم حدد Subtract Background.
في النافذة المنبثقة، قم بتعيين نصف قطر كرة التمرير إلى 50 بكسل ثم انقر على OK وحدد Yes في نافذة Process Stack. بعد ذلك، ضمن قائمة Analyze، حدد Tools، ثم اختر ROI Manager لفتح نافذة ROI. استخدم أداة التحديد الحرة لتحديد مناطق الاهتمام حول الخلايا الفردية.
في نافذة ROI، اختر Add لحفظ المخطط المحدد. ثم انقر على Measure لإنشاء نتائج المنطقة والمتوسط والانحراف المعياري والكثافة المتكاملة. كرر العملية لخلايا متعددة من نفس اليرقة عبر كل من القنوات الخضراء والحمراء بشكل منفصل.
بعد تصدير النتائج إلى جدول بيانات، قم بقياس نسبة الأحمر إلى الأخضر أو R بـ G لكثافة التكامل لكل خلية، ومتوسط هذه القيم لحساب نسبة R بـ G المتوسطة لكل اليرقة لكل من الصور قبل التحفيز وبعده. أخيرًا، قم بحساب التغيير في التألق أو دلتا R بـ G عن طريق طرح نسبة R بـ G قبل التحفيز من نسبة R بـ G بعد التحفيز لتحديد النشاط الكالسيومي لما بعد التشابك. أظهرت دراسات الاتصال الوظيفي بين الخلايا العصبية ذات التشعب الكثيف من الفئة الرابعة أو cIVda والخلايا العصبية المتوسطة في basin-4 في اليرقات من المرحلة الثالثة أن الخلايا العصبية المتوسطة في basin-4 أظهرت تألقًا أخضر بسبب التعبير السيتوزولي عن CaMPARI قبل التحويل الضوئي وتحفيز الضوء البصري.
لم يتم اكتشاف أي تألق أحمر في ظروف خط الأساس، مما أكد عدم وجود تحويل ضوئي قبل التحفيز. أدى تعرض الضوء الضوئي للتحويل الضوئي المتزامن والتحفيز البصري إلى حدوث تحويل ضوئي لـ CaMPARI من التألق الأخضر إلى الأحمر. يشير عدم وجود تألق أحمر في الضوابط إلى أن التحويل الضوئي كان مدفوعًا بشكل خاص بواسطة النشاط العصبي المتوسط بواسطة csChrimson.
كانت دلتا التألق الأحمر باللون الأخضر أعلى بكثير في الحيوانات التجريبية مقارنةً بالضوابط بدون ATR. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتأكيد الشراكة التشابكية من خلال تمكين تتبع التحفيز ما قبل التشابكي متبوعًا بردود الفعل ما بعد التشابكية الفورية في الحيوانات الحية أثناء التطور. الخطوة الأكثر تحديًا هي تثبيت الحيوان بشكل صحيح الذي سيتطلب ضغطًا كافيًا لمنع الحركة دون إلحاق الأذى بالحيوان.
قد تمكن الدراسات المستقبلية من تتبع، تشكيل، وتعزيز، وحتى القضاء على الوصلات التشابكية بين مجموعات عصبية محددة أثناء تطور الحيوان.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a method to functionally validate synaptic connectivity in the Drosophila larval nervous system by combining optogenetic activation with CaMPARI-based calcium imaging. The approach enables researchers to assess activity-dependent synaptic signaling between identified sensory neurons and interneurons in intact, undissected third-instar larvae.
Key Study Components
Area of Science
- Neurobiology
- Functional connectomics
- Optogenetics
- Calcium imaging
Background
- Connectome studies have mapped synaptic connectivity in various species, including Drosophila.
- Electron microscopy provides detailed anatomical data but lacks functional information.
- Recent Drosophila research has identified key neuronal networks underlying specific behaviors, such as nociception.
- Class IV dendritic arborization (cIVda) sensory neurons form major synaptic contacts with Basin-4 interneurons by the third instar larval stage.
Purpose of Study
- To functionally assess synaptic connectivity between cIVda nociceptors and Basin-4 interneurons in Drosophila larvae.
- To demonstrate the utility of CaMPARI as an activity-dependent reporter in live, undissected larvae.
- To establish a proof-of-principle protocol combining optogenetic stimulation and CaMPARI photoconversion.
Methods Used
- Immobilization of third-instar Drosophila larvae on microscope slides.
- Optogenetic activation of cIVda nociceptors using the red-shifted channelrhodopsin CsChrimson.
- Simultaneous CaMPARI photoconversion in Basin-4 interneurons to detect calcium influx.
- Fluorescence imaging to monitor CaMPARI color change as a readout of synaptic activity.
Main Results
- Calcium-dependent photoconversion of CaMPARI was observed in Basin-4 interneurons following optogenetic stimulation of cIVda neurons.
- The method provided functional evidence of synaptic connectivity despite internal larval movements and focal plane changes.
- The approach validated the anatomical connections identified by connectome studies with functional data.
Conclusions
- CaMPARI-based photoconversion is a reliable indicator of synaptic activation in intact Drosophila larvae.
- The protocol enables functional validation of connectomic data in vivo.
- This method can be broadly applied to study neuronal network function in genetically tractable organisms.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Functional validation of synaptic connectivity is critical for de-risking target selection and advancing mechanistic understanding in neurobiology-driven drug discovery. This CaMPARI-based approach enables direct assessment of activity-dependent signaling between defined neuronal partners in intact systems, bridging the gap between anatomical connectomics and actionable functional data. Such methods enhance predictive confidence at the target validation and early discovery inflection points, supporting portfolio decisions in CNS and neurodevelopmental pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of functional synaptic connectivity beyond anatomical mapping.
- Supports mechanistic de-risking by confirming physiologically relevant neuronal interactions.
- Improves predictive confidence for target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Facilitates development of validated, activity-dependent readouts for neuronal assays.
- Provides quantitative, ratiometric outputs suitable for reproducible screening workflows.
- Enables robust assay standardization by integrating optogenetic stimulation with functional imaging.
Translational & Preclinical Research
- Aligns functional synaptic data with disease-relevant neural circuits in preclinical models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking connectomic and functional endpoints.
- De-risks translational biomarker strategies by confirming in vivo neuronal activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target validation through assay development and preclinical research, providing a reusable platform for functional connectomics in genetically tractable systems.
- Discovery Biology: Validates synaptic function and pathway engagement in intact neural circuits.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible readouts for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables ratiometric measurement of calcium-dependent activity for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges anatomical and functional data to inform disease-relevant model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable workflow adaptable to diverse neuronal targets and circuits.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes functional readouts and supports reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and prioritizes targets with validated functional relevance.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of CNS and neurodevelopmental programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, calcium imaging, and genetic model systems.
- Needs fluorescence microscopy infrastructure and precise light delivery systems.
- Demands cross-team standardization for assay reproducibility and data interpretation.
- Adaptation to other model systems depends on genetic tractability and optical accessibility.
- Internal movement and focal plane changes in live imaging must be managed for reliable outputs.