التوصيف الوظيفي للشركاء الفرديين قبل وما بعد المشبك في الجهاز العصبي المركزي ليرقات ذبابة الفاكهة باستخدام CaMPARI

يركز بحثنا على تقييم الاتصال المشبكي الوظيفي بين شركاء العقد العصبية المحددة في يرقات ذبابة الفاكهة الحية والمفصلة. تتطلب الطرق التقليدية التشريح أو التحفيز الجسدي. يستخدم هذا البروتوكول علم البصريات في اليرقات السليمة، مما يقلل من الشوائب الأثرية.

للبدء، قم بإذابة وسط دقيق الذرة في الميكروويف لمدة 8-10 ثوان دون غليان ودعه ليبرد في درجة حرارة الغرفة دون أن يتصلب. قبل التبريد الكامل، أضف الريتينال العابر بالكامل (ATR) إلى تركيز 0.5 مليمولر لدعم الوسط للذباب الذي يحتاج إلى تنشيط csChrimson. غط القوارير بالكامل بورق الألمنيوم لمنع التعرض للضوء.

تتقاطع الإناث العذراء الحاملات لجينات CaMPARI وcsChrimson مع الذكور الحاملين لجينات GAL4 وLexA في القوارير البلاستيكية التي تحتوي على الوسط المحضر. جهز قوارير متوازية بدون ATR كأدوات تحكم. حضن القوارير عند درجة حرارة 25 درجة مئوية حتى تصل اليرقات إلى المرحلة الثالثة.

استخدم فرشاة رسم لجمع يرقة المرحلة الثالثة. اشطف اليرقة في طبق دقيق بثلاثة آبار يحتوي على 0.1 ضياع PBS مولر لإزالة أي طعام ملتصق. ضع كمية صغيرة من طين النمذجة في كل زاوية من غطاء نظيف بحجم 18 × 18 ملم.

ضع اليرقة في قطرة من PBS على غطاء الغطاء ودعها تتجه إلى الجانب البطني للأسفل. ضع شريحة ميكروسكوب نظيفة فوق غطاء الغطاء الذي يحتوي على اليرقة. ثبت غطاء الانزلاق عن طريق تطبيق طين النمذجة على الزوايا، باستخدام ضغط كاف فقط لتثبيت اليرقة دون سحقها أو كسر الزجاج.

ضع الشريحة التي تحتوي على اليرقة على مسرح مجهر كونفوكال مزود بعدسة موضوعية 40x/1.2. في واجهة برنامج المجهر، انقر على مباشرة. ثم تحت لوحة Z Stack، اضغط على Set First ثم Set Last ثم Stop للحصول على مجموعة Z الأساسية من الخلايا العصبية بعد المشبكية، معبرة عن CaMPARI.

تحت قائمة القنوات، قم بضبط القناة الخضراء بتردد 488 نانومتر مع قدرة ليزر 0.8٪. بعد ذلك، اضبط قناة 561 نانومتر الحمراء على 0.8٪ من طاقة الليزر. تحت قائمة Z Stack، اضبط قيمة الفاصل إلى 1 ميكرومتر.

في قائمة الاستحواذ، اختر الإعدادات المسبقة لضبط دقة 256 × 256 بكسل. خط بقيمة متوسطة 2، مسح ثنائي الاتجاه وسرعة مسح 9، مما يسمح بتحديث زمن البكسل تلقائيا. إجراء جميع التصوير في بيئة مظلمة، مع الحفاظ على معايير الاستحواذ المتطابقة طوال التجربة.

اضبط ضوء تحويل الضوء بتردد 405 نانومتر إلى 0.5٪ من طاقة الليزر. وضوء التحفيز البصري بحجم 561 نانومتر يصل إلى قدرة ليزر 0.8٪. انقر على مباشرة، ثم اختر أفضل ملاءمة تحت لوحة المخطط التكراري.

دع كلا الليزرين يحفزان اليرقة في نفس الوقت لمدة 30 ثانية، ثم أوقف التحفيز. خلال اكتساب ZStack بعد التحفيز باستخدام نفس معايير القاعدة الأساسية، لاحظ تألق كامباري الأحمر في الخلايا العصبية المحفزة بالليزر في يرقات تتغذى ب ATR مع تقليل التحويل الضوئي والضبط. في برنامج Fiji ImageJ، انقر على ملف، ثم اختر فتح.

في نافذة خيارات استيراد BioFormats مع الإعدادات الافتراضية، انقر على OK لفتح صورة ZStack المكتسبة. تحت قائمة الصورة، اختر اللون ثم قسم القنوات لعرض القنوات الحمراء والخضراء للصورة التي تم التقاطها. لطرح الخلفية، اضغط على المعالجة، ثم اختر طرح الخلفية.

في نافذة النوافذ المنبثقة، اضبط نصف قطر الكرة المتحركة على 50 بكسل ثم اضغط موافق واختر نعم في نافذة مكدس العمليات. بعد ذلك، في قائمة التحليل، اختر الأدوات، ثم اختر مدير العائد على الاستثمار لفتح نافذة العائد على الاستثمار. استخدم أداة الاختيار الحر لتحديد مناطق الاهتمام حول الخلايا الفردية.

في نافذة العائد على الاستثمار، اختر إضافة لحفظ المخطط المحدد. ثم انقر على القياس لتوليد نتائج المساحة، المتوسط، الانحراف المعياري، والكثافة المتكاملة. تكرار العملية لعدة خلايا من نفس اليرقة عبر قناتين خضراء وحمراء بشكل منفصل.

بعد تصدير النتائج إلى جدول بيانات، قس نسبة الأحمر إلى الأخضر أو نسبة R إلى G للكثافات المتكاملة لكل خلية، وقم بمتوسط هذه القيم لحساب متوسط نسبة R إلى G لكل يرقة لكل من الصور قبل وبعد التحفيز. وأخيرا، احسب التغير في الفلورة أو دلتا R بمقدار G عن طريق طرح نسبة التحفيز المسبق R ب G من نسبة R إلى G بعد التحفيز لقياس نشاط الكالسيوم بعد المشبك. أظهرت دراسات الترابط الوظيفي بين الخلايا العصبية التشعبية الشجرية من الفئة الرابعة أو cIVda وخلايا الحوض 4 في يرقات الطور الثالث أن خلايا الحوض 4 أظهرت فلورة خضراء بسبب تعبير CaMPARI السيتوسولي قبل التحويل الضوئي والتحفيز الضوئي البصري.

لم يتم اكتشاف أي فلورة حمراء في ظروف الأساس، مما يؤكد غياب التحول الضوئي قبل التحفيز. أدى التعرض المتزامن للضوء في تحويل الضوء والتحفيز البصري إلى تحويل الضوء من الفلورة الخضراء إلى الحمراء بواسطة CaMPARI. غياب الفلورة الحمراء في الميدان يشير إلى أن التحويل الضوئي كان مدفوعا تحديدا بنشاط عصبي بوساطة csChrimson.

كان الفلورة الخضراء في دلتا الأحمر أعلى بشكل ملحوظ في الحيوانات التجريبية مقارنة بعدم وجود عناصر ضبط ATR. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتأكيد الشراكة المشبكية من خلال تمكين تتبع التحفيز قبل المشبك تليها استجابات فورية بعد التشابك في الحيوانات التي تتطور حية. أصعب خطوة هي أن تثبيت الحيوان بشكل صحيح يتطلب ضغطا كافيا لمنع الحركة دون إيذاء الحيوان.

قد تمكن الدراسات المستقبلية من تتبع وتكوين وتقوية وحتى إزالة الاتصالات المشبكية بين مجموعات عصبية محددة أثناء نمو الحيوان.