برنامج رسم المعلمات الدقيقة الدبقية (MMPS): أداة مفتوحة المصدر وسهلة الاستخدام لتحليل شكل الخلايا الدبقية الصغيرة الكمية

يتيح لنا برنامج رسم خرائط معلمات الميكرودبقية، أو MMPS، دراسة كيف يغير الفيروبتوزيس التجمعات الفرعية الدقيقة للدبق بعد السكتة الدماغية الإقفارية. يعالج نظام MMPS عنق الزجاجة الرئيسية في مجال تحليل الميكرودبقية، متجاوزا متطلبات البرمجيات المرهقة والمعرفة البرمجية المطلوبة. للبدء، افتح مستودع GitHub على الكمبيوتر وقم بتحميل برنامج تعيين المعلمات الدقيقة الدبقية (MMPS) المستقلة.

في مجلد التنزيلات، انقر مرتين لتشغيل أداة الأرشيف لاستخراج المجلد المضغوط تلقائيا. انقر مرتين على أيقونة تطبيق MMPS المستخرج للتحقق وفتح حزمة MMPS. انقر على خيار اختيار مجلد الصورة وتصفح مجلد الكمبيوتر للعثور على ملفات المشروع.

امنح صلاحيات الوصول إلى المجلد واختر مجلد تخزين الصور. بعد ذلك، اضغط على اختيار مجلد الإخراج، ثم اختر مجلد الإخراج. اختر الصورة التي ستتم معالجتها، ثم اختر تسمية الصورة.

خصص معرفات الحيوانات ومجموعات العلاج للصورة وحفظ المدخلات. لحساب حجم بكسل الصورة، اختر المعايرة من شريط المقياس. اختر نقطة البداية والنهاية في شريط المقياس، وأدخل مسافة شريط المقياس المعروفة بالميكرومتر واضغط على تطبيق.

اختر قناة الفلورة التي تحتوي على إشارة الميكروبرال. اختر الصور للمعالجة بتحديد المربع بجانب اسم كل صورة، وقم بمعالجتها بشكل فردي إذا كان الفلورة في الخلفية تختلف بين الصور. راجع تبويبات النسخة الأصلية، المعاينة، المعالجة، وعلامات التبويب للأقنعة لمقارنة مراحل معالجة الصور.

اختر معاينة الصورة الحالية لضبط إعدادات معالجة إضافية. لطرح الخلفية، اضبط قيمة الكرة المتدحرجة بين خمسة و150 بكسل. لتقليل تشوهات الإضاءة، استخدم قيمة إزالة الضوضاء بقيمة ثلاثة، واضبط قيم الحدة بين واحد واثنان لتحسين تعريف الحواف.

بعد تحسين إعدادات معالجة الصور، انقر على معالجة الصور المحددة. بعد ذلك، اختر السومات، كل الصور. انقر على عرض اللون C لعرض RGB المركب.

اختر القنوات، ثم قم بإلغاء تحديد أي قنوات غير مستخدمة إذا بدت الصورة مشوهة بالألوان. انقر على تعديلات الشاشة لضبط سطوع القناة في عرض RGB. اختر ميكروبريا سوما التي تظهر DAPI وجزيء محول ارتباط الكالسيوم المؤين واحد، أو تداخل IBA1.

قم بإزالة SOMA الذي تم تحديده بشكل خاطئ باستخدام مفتاح الباكسبيس أو الحذف (delete). اضغط Enter أو Return للانتقال إلى الصورة التالية. اختر مخطط سوماس بعد الانتهاء من اختيار السوما.

حدد محيط السوما لكل خلية ميكرو بريا مختارة مع ثماني نقاط على الأقل، باستثناء العمليات الخلوية. قم بإزالة نقاط المخطط الموضوعة بشكل خاطئ باستخدام التراجع عن النقطة الأخيرة، الحذف، أو المسافة العكسية. اضغط إدخال، إرجاع، نقرة مزدوجة، أو بزر الفأرة الأيمن لإنهاء كل مخطط سوما.

انقر على توليد جميع الأقنعة بعد الانتهاء من مخطط السوما. في إعدادات توليد الأقنعة، قم بضبط الحد الأدنى للشدة لتقليل بكسل الخلفية وموازنة قمع الخلفية والحفاظ على الفروع. اختر جميع الكمامات لبدء ضمان جودة الكمامات، وراجع جميع الكمامات المعروضة من أكبر إلى أصغر المناطق.

قارن كل قناع مع الميكروغليا المقابلة باستخدام علامات التبويب المعالجة والقناع. لقبول الأقنعة، استخدم اختصار لوحة مفاتيح A. لرفض الأقنعة، استخدم اختصار لوحة مفاتيح R.

لإلغاء القبول أو الرفض، اضغط B. استخدم مفاتيح الأسهم في لوحة المفاتيح للتنقل بين أحجام الأقنعة. اختر أكبر قناع مقبول يلتقط تفرعات الخلايا الدبقية الدقيقة بدقة دون تضمين الخلايا المجاورة، أو الخلفية الزائدة، أو حدود الصورة، أو أشرطة المقياس. إذا كانت معظمها غير دقيقة، استخدم خيار مسح كل الأقنعة لإعادة توليد الأقنعة بقيمة عتبة مختلفة.

بعد ذلك، اختر حساب الخصائص البسيطة لحساب معلمات مختلفة للأقنعة المقبولة، ثم اضغط على موافق. لمزيد من التحليل، قم بتحميل fractalanalysisimagej. باي، شول.

PY، وSkeletonanalysisimageJ. إضافات py. لتحليل الكسور والهيكل، افتح وشغل تحليل فراكتال imagej.

py كإضافة فيجي. ثم أدخل موقع مجلد الإخراج. أدخل حجم البكسل واختر الخيار الأكبر للقناع فقط لتحليل أكبر قناع مقبول لكل خلية.

لتحليل الشول، افتح الشول. py كإضافة فيجي. أدخل موقع مجلد الإخراج، حجم البكسل المطلوب، حجم الخطوة.

اختر استخدام نصف قطر السوما كنصف قطر بداية، أو أدخل قيمة نصف قطر سومة ثابتة إذا لم تستخدم أنصاف نصف قطر السوما المشتقة من MMPS. افتح تحليل الهيكل العظمي. py كإضافة فيجي لتحليل الهيكل العظمي.

تصفح وأدخل المسارات الخاصة بمجلد الأقنعة، ودليل الإخراج، وحجم البكسل عند طلب ذلك. عند الانتهاء، تصدير جميع النتائج التي تم إنشاؤها من الإضافات كملفات قيم مفصولة بفاصل إلى أدلة الإخراج المحددة. أظهرت دراسة التحقق من صحة MMPS باستخدام نموذج التهاب عصبي للقوارض الناجم عن الدهون أو LPS أن إعطاء LPS قلل بشكل ملحوظ من متوسط مسافة مركز الدماغ ومحيط الخلية مقارنة بمجموعة الضوابط المعالجين بالمركبات.

لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في مساحة الكمامة أو استدارتها أو الشذوذ بين مجموعات العلاج. زادت مساحة السوما بشكل ملحوظ في الحيوانات المعالجة ب LPS مقارنة بضوابط المركبات المتوافقة مع إعادة تشكيل الخلايا الدبقية المرتبطة بالتنشيط الظاهري. لاحقا، أظهرت التحليلات الشكلية المتقدمة وجود ارتباط ضعيف فقط بين استدارة الخلايا الدبقية الصغيرة ومحيطها في الفئران المعالجة بالمركبات، وارتباط قوي في الفئران المعالجة ب LPS، مما يشير إلى ارتباط زيادة تنشيط الخلايا الدبقية بانخفاض الاستدارة والمحيط.

بالإضافة إلى ذلك، أظهرت منطقة القناع ارتباطات إيجابية قوية مع متوسط مسافة الجنود المركزية في كل من مجموعات المركبات والمجموعات المعالجة ب LPS، متوافقة مع التغيرات في التفرع المرتبطة بتنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة التفرعات الدقيقة للدبقية الدقيقة، والتجانس الشكلي، والتعقيد البنيوي. الحصول على صور مناعية فلورية عالية الدقة أمر بالغ الأهمية لاستخدام MMPS بدقة.

يمكن للدراسات المستقبلية استخدام MMPS لدراسة كيفية تغيير مثبطات الفيروبتوتيك لشكل الخلايا الدبقية بعد أمراض الجهاز العصبي المختلفة مثل السكتة الدماغية.