طريقة ChIRP معتمدة على الأشعة فوق البنفسجية للتعرف القابل للتحقق على البروتينات التي تتفاعل مباشرة مع LncRNA: من الخلايا المزروعة إلى خصيتي الفأر

طوّر بحثنا تقنية cPDiRT، وهي طريقة ربط متقاطع بالأشعة فوق البنفسجية لرسم خرائط التفاعلات بين RNA والبروتينات بشكل مباشر في كل من الخلايا المستنبتة والأنسجة الأصلية مثل الخصيتين، وكشف الآليات الجزيئية لـ TUG1 في عملية تكوين الحيوانات المنوية. يتيح هذا البروتوكول رسم خرائط مباشرة لتفاعلات RNA والبروتين في مجموعة أوسع من الأنظمة، بدءاً من الخلايا المستنبتة وصولاً إلى الأنسجة الأصلية السليمة. للبدء، اغسل خلايا GC2 ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة بقايا وسط الاستنبات.

بعد ذلك، أضف ثلاثة milliliters من PBS إلى الطبق ووزعها بالتساوي قبل عملية الربط التشابكي. عرض الخلايا للإشعاع في جهاز ربط تشابكي بالأشعة فوق البنفسجية بطول موجي 254-nanometer وبجرعة قدرها 4, 000 millijoules لكل square centimeter. اجمع الخلايا في PBS ثم قم بطرد معلق الخلايا مركزياً عند 3000G لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع degrees Celsius.

بعد التخلص من الطافي، قم بوزن الراسب للتأكد من أن الحد الأدنى لكتلة الراسب هو 500 milligrams لكل عينة. اجمع الخصيتين من ذكور الفئران من سلالة C57BL6 بعمر أربعة أسابيع. اغسل نسيج الخصية المنزوع الغلالة مرتين باستخدام 5 إلى 10 milliliters من DMEM.

بعد ذلك، يتم تحضين 100 milligrams من النسيج مع 10 milliliters من وسط DMEM الذي يحتوي على one milligram per milliliter من collagenase IV عند 37 °C. استمر في عملية الهضم لمدة تتراوح من 5 إلى 15 دقيقة حتى تتحرر الأنابيب المنوية. ثم، يتم طرد المعلق مركزياً عند 1000G لمدة دقيقة واحدة عند 4 °C وإزالة الطافي.

اغسل الراسب باستخدام 5 إلى 10 milliliters من DMEM. ثم قم بطرد المعلق مركزياً مرة أخرى عند 1000G لمدة دقيقة واحدة عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. وأعد تعليق الراسب في 0.25% trypsin يحتوي على one milligram per milliliter من deoxyribonuclease I. احضن المعلق عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة تتراوح من 5 إلى 15 minutes.

بعد ذلك، أضف حجماً مساوياً من وسط DMEM المكمل بنسبة 10%FBS لإيقاف الهضم الإنزيمي. قم بترشيح المعلق باستخدام مصفاة خلايا بمسامية 70-micrometer. ثم قم بطرد الخلايا مركزياً عند 2000G لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

تخلص من الطافي واغسل الراسب بـ 5 إلى 10 milliliters من PBS. قم بطرد السائل المركز للمعلق مرة أخرى عند 2000G لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربع درجات Celsius. أعد تعليق معلق الخلايا المفردة في PBS ووزعه بالتساوي على طبق استنبات بقطر 15 سانتيمتر.

قم بإجراء الربط التشابكي للخلايا الخصوية كما تم توضيحه سابقاً لخلايا GC2. استثنِ عملية التشعيع للخلايا الضابطة. ثم اجمع الخلايا المترابطة تشابكياً.

قم بطرد المعلق مركزياً عند 3000G لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C وتخلص من السائل الطافي. تأكد من الحصول على كتلة رواسب لا تقل عن 500 mg عن طريق تجميع الخلايا الخصوية المعزولة من 10 إلى 12 فأراً على الأقل. بعد وزن الرواسب، أعد تعليقها في محلول منظم لتحلل الخلايا بنسبة 100 mg من الرواسب لكل 1 mL من المحلول المنظم.

بعد الرج الدوامي، قم بمعالجة العينة بالموجات فوق الصوتية باستخدام جهاز سونيكاتور مركز أو حمام مائي سونيكاتور حتى يصبح المستخلص واضحاً بصرياً. بعد ذلك، وزع حوالي 10 µL من المستخلص في أنابيب طرد مركزي دقيقة لتحليل RNA والبروتين. أضف 30 µL من الحبيبات المغناطيسية المغسولة مسبقاً إلى المستخلص.

يتم تحضين العينات عند 37 °C لمدة 30 دقيقة مع الخلط اللطيف في فرن التهجين. توضع العينات على حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة تقريبًا أو حتى يصبح المحلول رائقًا. يُنقل المستخلص الرائق إلى أنبوب جديد.

ضع الأنبوب الجديد على الحامل المغناطيسي. بعد ذلك، انقل المستخلص إلى أنبوب آخر لإزالة أي حبيبات متبقية. أضف حجمين من محلول التهجين المُعدل حرارياً عند 37 درجة Celsius إلى كل عينة.

أضف مسابير DNA المبيوتنة بنسبة 1 µL من المخزون المسباري بتركيز 100 µM لكل 1 mL من المستخلص الخلوي. يتم تحضين العينات عند 37 °C مع تدويرها بشكل مستمر (end-over-end rotation) لمدة تتراوح من 12 إلى 16 ساعة في فرن تهجين. وقبل الاستخدام مباشرة، اغسل 100 µL من حبيبات الستربتافيدين المغناطيسية ثلاث مرات باستخدام محلول تحلل الخلايا.

ثم قم بإزالة المحلول المنظم المتبقي بعد الغسلة النهائية. قم بطرد مركزي سريع لأنابيب تفاعل التهجين. بعد ذلك، أضف العينة التي خضعت للتهجين إلى الخرز المغسول واخلط بلطف.

أعد تعليق الخرزات إلى الأنبوب الأصلي وحضنها عند 37 درجة مئوية مع الخلط لمدة تتراوح من 30 إلى 40 دقيقة. بعد الحضن، قم بطرد العينات مركزياً لفترة وجيزة. ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي لمدة دقيقة إلى دقيقتين، أو حتى يصبح المحلول صافياً.

بعد ذلك، يتم التخلص من السائل الطافي. ولغسل الخرزات، أضف 1 mL من محلول الغسيل المنظم واحضن الأنابيب في فرن التهجين عند 37 °C لمدة خمس دقائق. وبعد إجراء خمس غسلات، انقل 1-10% من الخرزات إلى أنبوب جديد لتحليل RNA.

أخيرًا، أضف 40 µL من منظم عينة 1X SDS إلى الخرزات المتبقية. اغْلِ العينات عند 95 °C لمدة 30 دقيقة لاستخلاص البروتينات وفك الروابط التشابكية. استعد البروتينات لإجراء تحليل مطيافية الكتلة اللاحق.

حدد تحليل مطيافية الكتلة بتقنية ChIRP أكثر من 190 بروتيناً تم إثراؤها مقارنة بالضابط السلبي في خلايا GC2. وعند جرعة UV تبلغ 4,000 millijoules per square centimeter، حددت تقنية cPDiRT-MS مجموعة بروتينية أكثر انتقائية. وتداخل أكثر من ثلثي هذه البروتينات مع تلك التي حددتها تقنية ChIRP-MS التقليدية.

تم الكشف بشكل متكرر عن معظم البروتينات التي تم تحديدها بوجود ببتيدين فريدين على الأقل عبر المكررات البيولوجية في كل من خلايا GC2 وخصيتي الفأر. وكشف تحليل الوجود الجيني (Gene ontology) للبروتينات التي تم تحديدها بشكل متكرر عن عمليات بيولوجية تتوافق بشكل واسع مع الوظائف المعروفة لـ TUG1. وأدت مقارنة مجموعات بيانات خلايا GC2 وخصيتي الفأر إلى تحديد 15 بروتيناً كانت مثرية بشكل مشترك.

كشف تسلسل الترسيب المناعي المشترك المترابط المعزز عن وجود قمم ارتباط واضحة ومحددة على نسخ TUG1 لكل من PABPC1 و CCT3. تتيح تقنية cPDiRT للباحثين تحديد وقياس البروتينات التي تتفاعل مباشرة مع RNA مرتبط محدد في كل من الخلايا المستنبتة والأنسجة الأصلية. ويكمن التحدي الأبرز في تحقيق ربط متقاطع فعال بالأشعة فوق البنفسجية مع ضمان خصوصية عالية للتفاعلات المباشرة بين RNA والبروتين.

سيدعم البروتوكول الخاص بنا الدراسات المستقبلية لتطبيق هذا النهج على أنواع أخرى من الـ RNAs والأنسجة لإعادة تفعيل دور الـ RNA البروتيني المباشر في عمليات النمو والتكاثر.