مبادئ في مواقع محددة التكنولوجيا (SSR) Recombinase

مرحباً، اسمي فرانك بوكهولز. أنا قائد مجموعة هنا في معهد ماكس بلانك لبيولوجيا الخلية الجزيئية وعلم الوراثة. وعملنا مستمر.

يتكون عملنا من جانبين؛ أحدهما يتعلق بفحص RNA I، والآخر يتعلق بتطوير إنزيم ريكومبينيز (recombinase) محدد الموقع من أجل الهندسة الوراثية المتقدمة.

خلفيتي العلمية هي أنني عالم أحياء، وتحديداً في مجال البيولوجيا الجزيئية، وقد درست البيولوجيا. بعد ذلك، حصلت على درجة الدكتوراه من المختبرات الأوروبية للبيولوجيا الجزيئية (EMBL) في هايدلبرغ، ثم أجريت أبحاث ما بعد الدكتوراه في سان فرانسيسكو في جامعة كاليفورنيا بسان فرانسيسكو (UCSF) مع مايك بيشوب، حيث عملت على نماذج حيوانية لمرض اللوكيميا. يحاول معهد ماكس بلانك هنا في دريسدن الجمع، لنقل، بين جانبين مختلفين على الأقل، وهما البيولوجيا التطورية وبيولوجيا الخلية، وذلك في محاولة تهدف أساساً -كما أعتقد- إلى فهم كيفية تكوين الخلايا للأنسجة.

هذا هو الهدف العام لهذا المعهد هنا في ستون. لذا، نحن نعمل بشكل أساسي في مجالين؛ يتعلق أحدهما بإجراء فحوصات RNAi، في محاولة لتحديد وظائف جديدة لجينات لم يتم توصيفها سابقاً في العمليات البيولوجية.

يتناول الجانب الآخر الهندسة الجينومية لمحاولة تطوير تقنيات تسمح بهندسة متطورة للجينومات باستخدام ريكومبينيز محدد الموقع (site-specific recombinase) على وجه الخصوص. وعلى الرغم من اكتشاف الريكومبينيز محدد الموقع، وأقول في الثمانينيات على سبيل المثال، فإن ريكومبينيز cre الذي نعمل معه قد اكتُشف في أوائل الثمانينيات. وهو في الواقع بروتين من عاثيات البكتيريا، لذا فهو مشتق أصلاً من عاثية بكتيرية، أي أنه في الأساس فيروس يصيب البكتيريا.

لذا، فهي تبتعد كثيراً عما يُستخدم حالياً، ولكن سرعان ما أُدرِك أن هذه الإنزيمات يمكنها أداء وظائف مثيرة للاهتمام يمكن استخدامها في كائنات أخرى أيضاً. إن بروتينات Recombinase النوعية للموقع هي بروتينات ترتبط بالـ DNA، حيث ترتبط بشكل محدد بتسلسل معين من الـ DNA، وعندما ترتبط بتسلسلات الهدف هذه، تكون قادرة على قطع الـ DNA ثم إعادة ترتيب المواقع بحيث تقوم أساساً بعملية الربط (ligation). ومرة أخرى، يمكنك إعادة ترتيب تسلسلات الـ DNA باستخدام هذا الاندماج النوعي للموقع، وهو ما يشبه إلى حد ما المقص والغراء، حيث يمكنك دمج تسلسلات الـ DNA بطريقة لم تكن مجتمعة من قبل.

وكما ذكرت، فإن إنزيمات ريكومبيناز محددة الموقع (Site-specific recombinase)، التي اكتُشفت في الأصل في البكتيريا أو في العاثيات البكتيرية، قد تم اختبارها لمعرفة ما إذا كانت تعمل أيضاً في كائنات أخرى. ومن المثير للاهتمام أنها أدت وظيفتها في كائنات أخرى أيضاً.

لذا، إذا كان لديك موقع مستهدف لإنزيم إعادة التركيب المحدد للموقع في كائن حي قمت بهندسته وراثياً، على سبيل المثال، فإن هذه الإنزيمات ستؤدي وظيفتها. إن الاستخدام البارز جداً لإنزيمات إعادة التركيب المحددة للموقع هذه، وبالأخص تلك التي لا تتطلب أي عوامل مساعدة، مثل flip recombinase أو cre recombinase التي استخدمناها كنقطة انطلاق للعمل الذي نتحدث عنه هنا اليوم؛ فهي تعمل دون الحاجة إلى عوامل مساعدة.

وإذا قمت بالتعبير عنها في حيوان، على سبيل المثال، أو في خلايا حيوانية، فإنها تستطيع إيجاد التسلسلات التي تتعرف عليها في هذا الكائن الحي، ومن ثم تقوم أساساً بالقص واللصق في ذلك الموضع، وتستأصل تسلسلات معينة. لذا، فإن ما تم إنجازه، أو المجال الذي استُخدم فيه هذا الإنزيم بنجاح كبير، هو ما يسمى بالطفرات الموجهة شرطياً في الفئران، على سبيل المثال. لنفترض أن لديك جيناً تعلم أنه جين مثير للاهتمام، وتريد معرفة وظيفة هذا الجين.

تعد تجربة إنشاء ما يسمى بالفأر المعطل جينياً (knockout mouse) تجربة بارزة للغاية. وبالنسبة لمن اطلعوا على المستجدات مؤخراً، فقد مُنحت جائزة نوبل لهذا العام لهذه التقنية، والتي تهدف أساساً إلى إجراء حذف لجين معين في الفأر. ومع ذلك، قد تجد أحياناً عند تعطيل جين في حيوان ما أن هذا الجين أساسي، مما يؤدي إلى وفاة الفأر في مرحلة مبكرة جداً أثناء التخلق الجنيني.

يوضح لك هذا الأمر أن جينك مهم للغاية، ولكن هذا لا يخبرك فعلياً بما هي وظيفته. لذا، فإن إحدى الطرق البارزة المستخدمة اليوم لمعرفة ذلك هي إجراء ما يسمى بـ "التعطيل الجيني الشرطي" (conditional knockout). وما تقوم به هو إحاطة الجين المستهدف بمواقع استهداف لإنزيمات الـ recombinase المحددة للمواقع.

وهذا يعني أنه في هذه الفئران، سيتم التعبير عن الجين كما هو الحال في الفئران من النوع البري. ولكن الآن، إذا قمت بتزاوج هذه الفئران مع فأر يعبر عن إنزيم CRE recombinase، على سبيل المثال، تحت مُحفز محدد للأنسجة، حينئذٍ يمكنك حذف الجين المستهدف في خلايا معينة فقط يمكنك تحديدها مسبقاً بناءً على مكان التعبير عن إنزيم recombinase. ومن هذه التجارب، نعلم أيضاً أن عمليات إعادة التركيب هذه يمكن أن تكون فعالة جداً في حذف التسلسلات من الكائنات الكاملة.

وكان هذا شرطاً أساسياً لفكرتنا المتمثلة في محاولة تطوير ريكومبينيز (recombinase) يقطع في الموقع الذي حددناه مسبقاً، وهو ما كان يمثل حتى الآن أحد العوائق الرئيسية أمام التطوير الإضافي للريكومبينيز المتخصص في مواقع محددة، حيث كان يتعين عليك هندسة موقع التعرف المستهدف في جينوم خلية الكائن الحي الذي ترغب في استخدامه. لذا تساءلنا: هل يمكننا كسر هذا الحاجز؟

تعتمد هذه العملية أساساً على التطور الجزيئي. وفي الوقت الحالي، لا تُستخدم إنزيمات ريكومبيناز المحددة للموقع (site specific recombinase) في العلاج، حسب علمي. وكما ذكرت، يرجع ذلك أساساً إلى عدم وجود موقع مستهدف في جسم الإنسان يمكن التعرف عليه بواسطة أي من إنزيمات الريكومبيناز المتاحة طبيعياً.

لذا، يجب تغييرها أولاً لتصبح قابلة للاستخدام في سياق علاجي. ونحن الآن في البداية فقط لمعرفة ما إذا كان هذا الأمر ممكناً على الإطلاق. لذا فإن الوقت كفيل بتحديد ما إذا كنا قادرين حقاً على تطوير هذه الإنزيمات للاستخدام العلاجي، وما إذا كان ذلك ممكناً أم لا.