في المختبر والمجراة في ضوء بارد مراسل التصوير الجيني للخلايا منشأ جنينية بشرية
مايو 2, 2008
مع تزايد الاهتمام في علاجات الخلايا الجذعية ، وتقنيات التصوير الجزيئي مثالية لمراقبة سلوك الخلايا الجذعية بعد الزرع. وقد مكنت الجينات مراسل Luciferase غير الغازية ، وتقييم المتكررة لبقاء الخلية ، والموقع ، وانتشارها في الجسم الحي. وهذا الفيديو لشرح كيفية تعقب انتشار hESC في ماوس المعيشة.
في الجسم الحي ، تكوين الورم المسخي هو المعيار الذهبي لتحديد تعدد القدرات للخلية أو قدرتها على تكوين جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. تعتبر الأورام المسخية أيضا عقبة كبيرة أمام زرع الخلايا الجذعية ، ولا يعرف حاليا سوى القليل عن تكوينها في حركية النمو. بمجرد زرع الخلايا غير المتمايزة في البيئة المضيفة ، فإن تطوير المراسل الحيوي ، ونقل الجينات والجهاز المقترن بالشحنة فائقة الحساسية أو التصوير الفوتوغرافي CCD قد أتاح التقييم المتكرر غير الجراحي لهجرة موقع الخلية والانتشار والتمايز في الجسم الحي.
في هذا الفيديو ، سنعرض بروتوكولا مفصلا لتتبع تكاثر الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المزروعة بشكل فعال في فأر حي. مرحبا ، أنا كيت ويلسون من مختبر جوزيف وو في قسمي الطب والأشعة بجامعة ستانفورد. سنعرض لك اليوم إجراءات تصوير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، سواء في المختبر أو بعد الزرع في فأر حي.
تتضمن هذه الإجراءات الخطوات التالية في التصوير الحيوي في المختبر للخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، وتحضير الفئران وحقن الخلايا الجذعية للتصوير في الجسم الحي والتصوير الحيوي في الجسم الحي للخلايا المزروعة. لذلك دعونا نبدأ بمراجعة بعض المكونات الرئيسية لهذه الإجراءات. من أجل إجراء تصوير التلألؤ البيولوجي للخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، تحتاج أولا إلى الحصول على الخلايا التي تعبر بثبات عن جينات مراسل EL luciferase مثل لوسيفيراز اليراع ، مدفوعا بمحفز تأسيسي مثل ubiquitin أو eef one alpha culture ، والخلايا الجذعية الجنينية البشرية الإيجابية EL Luciferase في ظروف خالية من المغذية.
عادة ما نتبع بروتوكول الخلية Y القياسي ونستخدم ستة ألواح بئر مطلية ب matrigel باستخدام وسائط الحالة أو وسائط التغذية التجارية الخالية من المواد. للكشف عن الخلايا الإيجابية لوسيفيراز ، ستحتاج إلى أن يكون مسبار المراسل د لوسيفر ، مستعدا بالفعل للقيام بذلك. Aliquot لوسيفر في مستحضرات واحدة إلى 1.5 ملليلتر بتركيز نهائي يبلغ 45 ملليغرام لكل ملليلتر.
احتفظ بالحقول عند 20 درجة مئوية تحت الصفر عندما لا تكون قيد الاستخدام وتجنب التعرض للضوء عن طريق تغطيتها بمنشفة ورقية عندما لا تكون في التخزين. لتصور الخلايا الموجبة لوسيفيراز ، سنستخدم نظامين مختلفين للتصوير. بالنسبة للإجراء في المختبر ، سنستخدم نظام صور معقمة ، Xeno IVUS 50 ، وبالنسبة للجهاز في الجسم الحي ، سنتوجه إلى مركز ستانفورد للتصوير في الجسم الحي لاستخدام Xeno IVUS 200.
يشتمل هذا النظام على جهاز لورين متكامل وغرفة تحريض للتخدير المؤقت للحيوانات الصغيرة. حسنا ، لقد حصلت على. دعنا ننتقل إلى التصوير الحيوي في المختبر.
بالنسبة للتصوير الحيوي في المختبر ، من المهم الحفاظ على ظروف معقمة. لذلك ، يجب أن يكون نظام التصوير معقما ، ويفضل أن يكون ذلك في غرفة زراعة الخلايا. قبل التصوير ، قم بإزالة الوسائط الخلوية وأضف ما يكفي من PBS لتغطية الخلايا.
على سبيل المثال ، أضف ملليلترا واحدا من PBS إلى كل بئر من ستة صفيحة تحتوي على مزارع الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. يجب أن تكون نسبة الديرين إلى PBS واحدة إلى 100. لذا أضف 10 ميكرولترات من ديرين الذوبان إلى كل بئر من صفيحة الآبار الستة.
تذكر أن تصفية الديرين قبل إضافته إلى ثقافاتك. بعد الانتظار لمدة دقيقة واحدة ، ضع اللوحة في الغرفة ، ثم التقط صورة باستخدام وقت التعرض البالغ 10 ثوان ، واضبط وقت التعرض. إذا كانت الإشارة مشبعة أو ضعيفة جدا ، فإن إشارة التلألؤ البيولوجي تعكس رقم الخلية ، لذلك يمكن إجراء فحوصات القياس الكمي التي تربط الإشارة بأرقام الخلايا المختلفة.
هذه صور مأخوذة من مقايسة كمية نموذجية. يوجد في الجزء العلوي الأيسر حقل مشرق لبعض مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. نحن نعلم أن هذه الخلايا تحمل جين مراسلنا لأنها تتألق باللون الأخضر بعد الحقيقة.
فرز اللون الأزرق هو تلطيخ باهت. تظهر اللوحة السفلية آبارا ثقافية بها أعداد متزايدة من الخلايا. ترتبط أعداد الخلايا بإشارة التلألؤ البيولوجي كما هو موضح في هذا الرسم البياني.
يعطينا هذا الارتباط فحصا شبه كمي لتتبع تكاثر الخلايا في الجسم الحي. حسنا ، هذا هو الإجراء في المختبر. الآن دعنا ننتقل إلى تصوير التلألؤ البيولوجي في الجسم الحي.
لتصوير تكوين الورم المسخي في الجسم الحي ، سنقوم بحقن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي تعبر عن جين مراسل اليراع لوسيفيراز في الجزء الخلفي من الفأر الانزلاقي ونلتقط صورا مضيئة بيولوجيا باستخدام نظام IVU. عندما تكون مستعدا لزرع الخلايا ، استخدم مساحة القرص أو الكولاجيناز لفك الخلايا التي تغسل عدة مرات وتعليقها في مزيج فردي من عامل النمو ، وتقليل matrigel و dmm. عادة ، نقوم أولا بخلط الخلايا مع DMM المبرد ثم نضيف matrigel.
لكل موقع تحت الجلد ، نقوم بحقن 200 ، 000 خلية معلقة في حجم 50 إلى 100 ميكرولتر من خليط matrigel DMM. يمكن تعديل رقم الخلية حسب التطبيق الخاص بك. تذكر أن تبقي كل شيء على الجليد قبل الحقن.
بمجرد أن تصبح الخلايا جاهزة ، نقوم بتخدير الفأر عن طريق وضعه في صندوق الحث. مع تشغيل تدفق الفلور الأيزو. بعد حوالي دقيقة واحدة ، يتم تخدير الماوس ويمكن وضعه على طاولة العمليات باستخدام فلور ISO المستمر.
نظرا لأنه بالنسبة للتألق التلقائي بشكل طبيعي وقد يحجب الصورة الحيوية ، سنحتاج إلى إزالة الشعر من مؤخرة الفأر. أسهل طريقة للقيام بذلك هي استخدام ماكينة حلاقة كهربائية ، ولكن يمكنك أيضا استخدام المواد الهلامية لإزالة الشعر ، والمسح بالكحول لتعقيم الجلد بعد ذلك. بعد ذلك ، قم برسم تعليق خلية مائة ميكرولتر في حقنة من 23 إلى 27 إبر قياس تعمل بشكل أفضل لأنها لن تسد مع الخلايا.
الآن ، قم بحقن الخلايا الموجودة تحت الجلد في ظهر الفأر لأن الجلد فضفاض تماما. استخدم الإبهام والسبابة لقرص المنطقة التي تريد حقنها وتمديدها. حقن تحت الجلد مباشرة مع الحرص على عدم ثقب عميق جدا.
حاول أيضا منع الإبرة من الانزلاق خارج موقع الحقن أثناء الضغط على المكبس. سيمنع ذلك إحداث ثقب في الجلد يمكن أن تتسرب من خلاله الخلايا. إذا حاولت الحقن مرة أخرى بعد حقن الخلايا ، فانتظر بضع ساعات للسماح للفأر بالاستيقاظ والركض قبل إعادته إلى وضع السكون.
بالنسبة للتصوير الحيوي ، يؤدي القيام بذلك إلى تجنب سمية الأيزوفلوران. حسنا ، نحن الآن مستعدون للمضي قدما في التصوير الحيوي في الجسم الحي للخلايا المحقونة. بالنسبة لدراسات التصوير التالية ، سنستخدم فأرا بدأ بالفعل في إظهار تكوين ورم مسخي لتصوير التلألؤ البيولوجي للحيوان بالكامل.
نقوم بحقن لوسيفر داخل الصفاق عند 375 ملليغرام لكل كيلوغرام من وزن الجسم. لذلك ، نحتاج إلى وزن المخدر لحساب الجرعة ، وحقن لوسيفر الفعل في الصفاق ، قبالة خط الوسط مباشرة ، والسحب على الإبرة والتأكد من عدم وجود دم ، وهو ما سيكون مؤشرا على أنك تضررت في عضو داخلي. إذا بدأ الماوس في الاستيقاظ ، فما عليك سوى وضعه مرة أخرى في غرفة الحث وانتظر دقيقة أو دقيقتين.
استعد للتصوير عن طريق وضع ورق أسود غير لامع في صندوق التصوير للمساعدة في امتصاص أي ضوء لا تنبعث من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية. بالنسبة للفئران ، تحدث إشارة التلألؤ البيولوجي القصوى عادة بعد 15 إلى 40 دقيقة من الحقن. لذلك بعد 10 إلى 15 دقيقة ، ضع مؤخرة الماوس لأعلى في غرفة التصوير باستخدام الفلور الأيزو.
ابدأ بوقت تعريض 10. إذا كانت الإشارة مشبعة ، فحاول تقليل وقت التعرض. إذا كان ضعيفا جدا ، فقم بزيادة التعرض.
بمجرد تحسين وقت التعرض للإشارة للماوس ، ابدأ في التقاط الصور كل دقيقة حتى تصل الإشارة إلى الحد الأقصى. من الأفضل القيام بذلك باستخدام برنامج التصوير لتحديد مناطق الاهتمام التي تغطي مواقع الحقن الخاصة بك. من خلال مراقبة شدة الإشارة في كل منطقة ذات اهتمام ، يمكنك بسهولة تحديد متى تبدأ الإشارة في الانخفاض ، مما يشير إلى أنه تم الوصول إلى الحد الأقصى لشدة الإشارة.
نأخذ متوسط ثلاث صور متتالية تحدث حول الحد الأقصى ونستخدمها كقيمة نهائية. عندما تكون راضيا عن صورك ، قم بإزالة الماوس من الفلور واسمح له بالاستيقاظ في قفصه. عادة يجب أن يستيقظ الماوس في غضون 15 دقيقة.
بعد المسار الزمني المطلوب لصور التلألؤ البيولوجي. يمكن التضحية بالحيوان في أقسام الأنسجة المستخدمة في الأنسجة. حسنا ، الآن بعد أن انتهينا جميعا من إجراءات التصوير في الجسم الحي ، يمكننا إلقاء نظرة فاحصة على نتائجنا وإلقاء نظرة أيضا على بعض الدراسات السابقة من مختبرنا.
فيما يلي صورة تلألؤ بيولوجي لثلاثة فئران مصابة بأورام مسخية تحت الجلد. تم تراكب بيانات إشارة التلألؤ الحيوي على صورة بالأبيض والأسود للفئران تم إجراؤها تلقائيا لنا بواسطة برنامج التصوير. هذا مثال على نوع التصوير الطولي الممكن باستخدام لوسيفيراز اليراع.
في هذه الحالة ، قمنا بحقن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مباشرة في القلب بعد الحقن الأولي. تموت معظم الخلايا خلال الأسبوع التالي كما هو موضح من انخفاض التلألؤ البيولوجي على القلب. لاحظ ، السهم الأسود.
تشكلالخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي تنجو من الزرع في النهاية ورما مسخي في القلب يمكن تصوره كإشارة سريعة الزيادة تبدأ في اليوم الرابع عشر تقريبا. ستلاحظ أنه في اليوم السابع ، هناك منطقة ثانية من التلألؤ البيولوجي يشار إليها بالسهم الأحمر الذي يظهر تسربا قلبيا إضافيا للخلايا الجذعية الجنينية البشرية إلى البطن. هذا شائع جدا.
لقد أوضحنا لك للتو كيفية الحصول على صور تلألؤ بيولوجي للخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي تعبر بثبات عن جين مراسل لوسيفيراز ، سواء في المختبر أو بعد الزرع في فأر حي. تسمح هذه الطريقة بالتصوير المتكرر ومراقبة تكاثر الخلايا دون الحاجة إلى التضحية بأعداد كبيرة من من أجل الأنسجة ، والتي قد تكون بطبيعتها غير دقيقة لقياس كمية الخلية. عند القيام بهذا الإجراء في الماوس ، من المهم أن تتذكر استخدام التركيز الصحيح من delucci وتجنب تشبع صورة التلألؤ الحيوي بفترات تعريض طويلة جدا.
هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يُظهر هذا الفيديو بروتوكولًا لتتبع تكاثر الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الجسم الحي باستخدام تقنيات التصوير الحيوي. تسمح الطريقة بتقييم غير باضع لسلوك الخلية بعد الزرع في نموذج فئران حي.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- أبحاث الخلايا الجذعية
- التصوير الجزيئي
- بيولوجيا الزرع
الخلفية
- تكوين الأورام المسخية هو مؤشر رئيسي على التعددية الإمكانية في الخلايا الجذعية.
- فهم حركية نمو الأورام المسخية أمر بالغ الأهمية لتحسين علاجات الخلايا الجذعية.
- تقنيات التصوير الحالية تسمح بتتبع سلوك الخلايا الجذعية في الجسم الحي.
- تسهل الجينات المبلغة الحيوية مراقبة موقع الخلية وتكاثرها.
هدف الدراسة
- لتوفير بروتوكول مفصل لتصوير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية.
- لتقييم بقاء الخلية وتكاثرها في نموذج فئران حي.
- لتعزيز فهم سلوك الخلايا الجذعية بعد الزرع.
الطرق المستخدمة
- نقل الجين المبلغ الحيوي المضيء.
- تصوير جهاز CCD فائق الحساسية.
- التصوير في الجسم الحي للخلايا الجذعية المزروعة.
- تقييم هجرة الخلية وتمايزها.
النتائج الرئيسية
- تتبع ناجح لتكاثر الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في الجسم الحي.
- مظاهرة لتقنيات التصوير غير الباضع لمراقبة الخلايا الجذعية.
- رؤى حول سلوك الخلايا الجذعية بعد الزرع.
- إنشاء بروتوكول للدراسات المستقبلية في أبحاث الخلايا الجذعية.
الاستنتاجات
- يوفر البروتوكول طريقة موثوقة لمراقبة سلوك الخلايا الجذعية.
- التصوير الحيوي فعال لتقييم ديناميكيات الخلية في الجسم الحي.
- تسهم هذه الدراسة في فهم علاجات الخلايا الجذعية وتحدياتها.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Bioluminescence reporter gene imaging enables non-invasive, longitudinal tracking of human embryonic stem cell (hESC) fate in vivo, addressing a critical challenge in regenerative medicine and cell therapy development. This approach provides quantitative, real-time insights into cell survival, proliferation, and teratoma formation, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking at early discovery and preclinical inflection points. The method enhances portfolio decision-making by enabling robust assessment of cell-based therapeutic candidates in translational models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of hESC engraftment, survival, and proliferation in living systems.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing viable from non-viable transplanted cells via reporter gene expression.
- Facilitates functional validation of pluripotency and teratoma risk in candidate cell lines.
- Provides quantitative, time-resolved data to inform target confidence and triage decisions.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, reproducible in vitro and in vivo imaging assays for cell tracking.
- Enables semi-quantitative correlation between cell number and bioluminescence signal for assay standardization.
- Supports scalable, high-throughput screening of cell survival and proliferation under varying conditions.
- Delivers robust readouts for compound or protocol optimization in cell-based workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vivo imaging outputs with disease-relevant models for translational continuity.
- Enables longitudinal monitoring of cell fate and teratoma formation in preclinical studies.
- Supports risk-adjusted advancement of cell therapy candidates based on real-time viability data.
- Provides a bridge from discovery to preclinical validation by enabling repeated, non-terminal assessments.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging platform integrates from early discovery through preclinical research, supporting hypothesis testing, mechanistic de-risking, and translational validation of hESC-based interventions.
- Discovery Biology: Quantifies cell survival and proliferation to clarify engraftment mechanisms and biological risk.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging assays for cell number and viability.
- Analytics: Provides longitudinal, semi-quantitative readouts for comparing experimental conditions and optimizing protocols.
- Translational Research: Enables non-invasive, repeated monitoring of cell fate in disease-relevant animal models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, scalable imaging capability applicable across diverse cell therapy programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell therapy R&D.
- Operational Value: Standardizes cell tracking workflows and minimizes animal use via non-terminal imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early detection of engraftment failure or teratoma risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cell-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in reporter gene engineering and in vivo imaging instrumentation.
- Demands access to sensitive CCD imaging systems and validated luciferase reagents.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and quantitative analysis.
- Must be adapted for different cell types, promoters, and animal models as needed.
- Signal quantitation may be affected by tissue depth, probe delivery, and animal handling variables.
