الكهربي فصل البروتينات

يمكن تحقيق فصل البروتينات الفردية من خلائط بروتينية معقدة عن طريق الفصل الكهربائي للهلام في الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد، والمعروف أيضاً باسم PAGE؛ حيث تهاجر البروتينات استجابةً لمجال كهربائي عبر مسام في مصفوفة الهلام. ويحدد المزيج بين حجم مسام الهلام وشحنة البروتين وحجمه وشكله معدل هجرة البروتين. سنقوم في هذا الفيديو بعرض طريقة للفصل الكهربائي للبروتينات.

أهلاً بكم، أنا الدكتور بوبول تشاكرافارتي من مركز البروتوميات في معهد كيك للدراسات العليا في علوم الحياة التطبيقية. سأعرض لكم اليوم إجراءً لتنفيذ الفصل الكهربائي للهلام أحادي البعد (1D gel electrophoresis). فلنبدأ.

في البداية، قم بتجميع شريحة الزجاج المزدوجة لجهاز الرحلان الكهربائي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام لوحين زجاجيين نظيفين وفاصلين بحجم 1.5 millimeter. الآن، قم بتثبيت شريحة الزجاج المزدوجة في حامل الصب. بعد ذلك، قم بتحضير محلول هلام الفصل الموصوف في البروتوكولات الحالية.

أضف الكمية المحددة من كبريتات الأمونيوم بتركيز 10% وTEDS إلى المحلول وحركه بلطف للمزج. ونظراً للتركيز العالي للأكريلاميد، فإن عملية إزالة الغازات ليست ضرورية. وباستخدام ماصة بلاستيكية disposable سعة 10 ملليلتر، قم بوضع محلول هلام الفصل مباشرة على "الساندوتش" على طول حافة أحد الفواصل حتى يصل ارتفاع المحلول بين الصفائح الزجاجية إلى حوالي 11 سنتيمتر.

بعد ذلك، استخدم ماصة أخرى لتغطية الجزء العلوي من الهلام ببطء بطبقة يبلغ سمكها حوالي واحد سنتيمتر من كحول أيزوبوتيل المشبع بالماء أو الماء المقطر. يتم ذلك عن طريق وضع الماء بلطف فوق حافة أحد الفواصل، ثم الحافة الأخرى، ثم اترك الهلام ليتعملمر 30 إلى 60 دقيقة. تضمن طبقة الماء المضافة في درجة حرارة الغرفة أن يتpolymerize هلام الأكريلاميد في خط مستقيم.

بمجرد بلمرة الهلام، نصبح مستعدين لصب هلام التجميع. أولاً، يتم سكب طبقة الماء المقطر، ثم الشطف باستخدام 1x tris CL في SDS عند pH 8.8. الآن قم بتحضير محلول هلام التجميع كما هو موضح في البروتوكولات الحالية.

بعد ذلك، وباستخدام ماصة بلاستيكية، اسمح لمحلول هلام التجميع بالتدفق ببطء في مركز "الساندوتش" على طول حافة أحد الفواصل حتى يصل ارتفاع المحلول في "الساندوتش" إلى حوالي سنتيمتر واحد من أعلى الصفائح. احرص على عدم إدخال فقاعات هواء في هلام التجميع. وبمجرد صب الهلام، أدخل مشط تيفلون بمقاس 0.75 مليمتر في طبقة محلول هلام التجميع.

اترك محلول هلام التجميع ليتكثّر لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وبعد ذلك نصبح مستعدين لتحضير عينات البروتين. لبدء عملية تحضير عينة البروتين، قم بتخفيف جزء من عينة البروتين المراد تحليلها بنسبة واحد إلى واحد باستخدام منظم عينات 2XSDS.

بالنسبة لمحاليل البروتين المخففة، يُنصح باستخدام خليط من البروتين إلى منظم عينات SDS بنسبة خمسة إلى واحد أو ستة مرات. أما إذا كانت العينة عبارة عن راسب بروتيني، فقم بإذابة البروتين في 50 إلى 100 µL من منظم عينات 1X SDS. بعد ذلك، يتم تسخين العينات لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق عند 100 °C في حمام مائي، باستخدام أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات غطاء لولبي محكم الإغلاق.

بعد ذلك، قم بإزالة مشط التفلون بعناية دون تمزيق حواف آبار البولي أكريلاميد. بعد إزالة المشط، اشطف الآبار باستخدام محلول SDS electrophoresis buffer بتركيز 1X. ثم باستخدام الماصة، املأ الآبار بمحلول SDS electrophoresis buffer بتركيز 1X.

بمجرد شطف الآبار وملئها بالمحلول المنظم، قم بتثبيت شطيرة الهلام في حجرة المحلول المنظم العلوية. وباتباع تعليمات الشركة المصنعة، املأ حجرة المحلول المنظم السفلية بالكمية الموصى بها من محلول SDS electrophoresis buffer بتركيز one X. بعد ذلك، ضع الشطيرة المثبتة في حجرة المحلول المنظم العلوية داخل حجرة المحلول المنظم السفلية.

الآن، املأ حجرة المنظم العلوية تمامًا بـ one XSDS electrophoresis buffer بحيث تمتلئ آبار العينات في هلام التجميع بالمنظم. أصبح الهلام الآن جاهزًا للتحميل باستخدام ماصة أوتوماتيكية سعة 25 أو 100 microliter مع رؤوس تحميل الهلام؛ قم بتحميل عينة البروتين في بئر واحد أو أكثر عن طريق وضع العينة بعناية كطبقة رقيقة في قاع الآبار. حمّل آبار التحكم بمعايير الوزن الجزيئي.

أضف أيضاً حجماً مساوياً من منظم عينات 1X SDS إلى أي آبار فارغة لمنع انتشار العينات في المسارات المجاورة. نحن الآن مستعدون لبدء الفصل الكهربائي للهلام. لتشغيل الهلام، قم بتوصيل مصدر الطاقة بالخلية وتشغيله بتيار ثابت قدره 30 mA لهلام لوحي بسمك 1.5 mm.

بعد وصول صبغة التتبع مينتول بلو إلى أسفل هلام الفصل، افصل مصدر الطاقة. والآن بعد اكتمال عملية الفصل الكهربائي، تخلص من منظم الفصل الكهربائي وأزل غرفة المنظم العلوية مع شطيرة الهلام الملحقة بها. قم بتوجيه الهلام بحيث يكون ترتيب آبار العينات معروفاً.

بعد ذلك، أخرج الشريحة (sandwich) من غرفة المحلول المنظم العلوية وضعها على ورقة ماصة أو مناشف ورقية. ثم ببطء، قم بسحب أحد الفواصل لمسافة نصف طوله من حافة الشريحة على امتداد طولها بالكامل. استخدم الفاصل المكشوف كرافعة لفتح اللوح الزجاجي، مما يؤدي إلى كشف الهلام بعناية.

قم بإزالة الهلام من اللوحة السفلية. اقطع مثلثًا صغيرًا من إحدى زوايا الهلام لضمان عدم فقدان توجيه المسارات أثناء الصبغ والتجفيف. وبذلك تكون عملية الرحلان الكهربائي للهلام قد اكتملت.

يمكن الآن معالجة الهلام باستخدام إجراءات مختلفة للكشف عن البروتين. لقد عرضنا لك للتو كيفية فصل البروتينات باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.