Name: الكهربي فصل البروتينات (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-06-12T13:29:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: تعلم تقنية الفصل الكهربائي للبروتينات باستخدام هلام البولي أكريلاميد (PAGE) لفصل البروتينات حسب الشحنة والحجم. هذه الطريقة تساعد الباحثين في تحليل البروتينات بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

بروتوكول النص الكامل لهذا النهج التجريبي هو متاح في <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471142720/cp/cpmb/article/mb1002a/current/abstract" target="_blank">البروتوكولات الحالية في البيولوجيا الجزيئية</a> .

ليس لدى المؤلفين أي تعارض في المصالح للإفصاح عنه.

الكهربي فصل البروتينات

Electrophoretic Separation of Proteins

ويستخدم الكهربي لفصل مخاليط معقدة من البروتينات (على سبيل المثال ، من الخلايا ، الكسور التحت خلوية ، كسور العمود ، أو immunoprecipitates) ، للتحقيق في التراكيب الوحيدات ، والتحقق من تجانس عينات البروتين. يمكن أن تستخدم أيضا لتنقية البروتينات لاستخدامها في تطبيقات أخرى. في هلام بولي أكريلاميد الكهربائي ، والبروتينات تهاجر ردا على الحقل الكهربائي من خلال المسام في المصفوفة هلام بولي أكريلاميد ؛ حجم المسام يتناقص مع زيادة تركيز مادة الأكريلاميد. مزيج من حجم المسام والمسؤول عن البروتين ، والحجم ، والشكل الذي يحدد معدل الهجرة من البروتين. في هذه الوحدة ، وصفت طريقة قياسية لLaemmli هلام إستشراد متقطع في ظل ظروف تغيير طبيعة ، أي في وجود كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS).

في هذا الفيديو ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لفصل الكهربي للبروتينات باستخدام بولي acrylimide الكهربائي للهلام (PAGE).

تُستخدم الرحلان الكهربائي لفصل المخاليط المعقدة من البروتينات (على سبيل المثال، من الخلايا، أو الأجزاء الخلوية، أو كسور الأعمدة الكروماتوغرافية، أو الرواسب المناعية)، بهدف...

يمكن تحقيق فصل البروتينات الفردية من خلائط بروتينية معقدة عن طريق الفصل الكهربائي للهلام في الفصل الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد، والمعروف أيضاً باسم PAGE؛ حيث تهاجر البروتينات استجابةً لمجال كهربائي عبر مسام في مصفوفة الهلام. ويحدد المزيج بين حجم مسام الهلام وشحنة البروتين وحجمه وشكله معدل هجرة البروتين. سنقوم في هذا الفيديو بعرض طريقة للفصل الكهربائي للبروتينات.أهلاً بكم، أنا الدكتور بوبول تشاكرافارتي من مركز البروتوميات في معهد كيك للدراسات العليا في علوم الحياة التطبيقية. سأعرض لكم اليوم إجراءً لتنفيذ الفصل الكهربائي للهلام أحادي البعد (1D gel electrophoresis). فلنبدأ.في البداية، قم بتجميع شريحة الزجاج المزدوجة لجهاز الرحلان الكهربائي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة باستخدام لوحين زجاجيين نظيفين وفاصلين بحجم 1.5 millimeter. الآن، قم بتثبيت شريحة الزجاج المزدوجة في حامل الصب. بعد ذلك، قم بتحضير محلول هلام الفصل الموصوف في البروتوكولات الحالية.أضف الكمية المحددة من كبريتات الأمونيوم بتركيز 10% وTEDS إلى المحلول وحركه بلطف للمزج. ونظراً للتركيز العالي للأكريلاميد، فإن عملية إزالة الغازات ليست ضرورية. وباستخدام ماصة بلاستيكية disposable سعة 10 ملليلتر، قم بوضع محلول هلام الفصل مباشرة على "الساندوتش" على طول حافة أحد الفواصل حتى يصل ارتفاع المحلول بين الصفائح الزجاجية إلى حوالي 11 سنتيمتر.بعد ذلك، استخدم ماصة أخرى لتغطية الجزء العلوي من الهلام ببطء بطبقة يبلغ سمكها حوالي واحد سنتيمتر من كحول أيزوبوتيل المشبع بالماء أو الماء المقطر. يتم ذلك عن طريق وضع الماء بلطف فوق حافة أحد الفواصل، ثم الحافة الأخرى، ثم اترك الهلام ليتعملمر 30 إلى 60 دقيقة. تضمن طبقة الماء المضافة في درجة حرارة الغرفة أن يتpolymerize هلام الأكريلاميد في خط مستقيم.بمجرد بلمرة الهلام، نصبح مستعدين لصب هلام التجميع. أولاً، يتم سكب طبقة الماء المقطر، ثم الشطف باستخدام 1x tris CL في SDS عند pH 8.8. الآن قم بتحضير محلول هلام التجميع كما هو موضح في البروتوكولات الحالية.بعد ذلك، وباستخدام ماصة بلاستيكية، اسمح لمحلول هلام التجميع بالتدفق ببطء في مركز "الساندوتش" على طول حافة أحد الفواصل حتى يصل ارتفاع المحلول في "الساندوتش" إلى حوالي سنتيمتر واحد من أعلى الصفائح. احرص على عدم إدخال فقاعات هواء في هلام التجميع. وبمجرد صب الهلام، أدخل مشط تيفلون بمقاس 0.75 مليمتر في طبقة محلول هلام التجميع.اترك محلول هلام التجميع ليتكثّر لمدة تتراوح من 30 إلى 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وبعد ذلك نصبح مستعدين لتحضير عينات البروتين. لبدء عملية تحضير عينة البروتين، قم بتخفيف جزء من عينة البروتين المراد تحليلها بنسبة واحد إلى واحد باستخدام منظم عينات 2XSDS.بالنسبة لمحاليل البروتين المخففة، يُنصح باستخدام خليط من البروتين إلى منظم عينات SDS بنسبة خمسة إلى واحد أو ستة مرات. أما إذا كانت العينة عبارة عن راسب بروتيني، فقم بإذابة البروتين في 50 إلى 100 µL من منظم عينات 1X SDS. بعد ذلك، يتم تسخين العينات لمدة تتراوح من ثلاث إلى خمس دقائق عند 100 °C في حمام مائي، باستخدام أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات غطاء لولبي محكم الإغلاق.بعد ذلك، قم بإزالة مشط التفلون بعناية دون تمزيق حواف آبار البولي أكريلاميد. بعد إزالة المشط، اشطف الآبار باستخدام محلول SDS electrophoresis buffer بتركيز 1X. ثم باستخدام الماصة، املأ الآبار بمحلول SDS electrophoresis buffer بتركيز 1X.بمجرد شطف الآبار وملئها بالمحلول المنظم، قم بتثبيت شطيرة الهلام في حجرة المحلول المنظم العلوية. وباتباع تعليمات الشركة المصنعة، املأ حجرة المحلول المنظم السفلية بالكمية الموصى بها من محلول SDS electrophoresis buffer بتركيز one X. بعد ذلك، ضع الشطيرة المثبتة في حجرة المحلول المنظم العلوية داخل حجرة المحلول المنظم السفلية.الآن، املأ حجرة المنظم العلوية تمامًا بـ one XSDS electrophoresis buffer بحيث تمتلئ آبار العينات في هلام التجميع بالمنظم. أصبح الهلام الآن جاهزًا للتحميل باستخدام ماصة أوتوماتيكية سعة 25 أو 100 microliter مع رؤوس تحميل الهلام؛ قم بتحميل عينة البروتين في بئر واحد أو أكثر عن طريق وضع العينة بعناية كطبقة رقيقة في قاع الآبار. حمّل آبار التحكم بمعايير الوزن الجزيئي.أضف أيضاً حجماً مساوياً من منظم عينات 1X SDS إلى أي آبار فارغة لمنع انتشار العينات في المسارات المجاورة. نحن الآن مستعدون لبدء الفصل الكهربائي للهلام. لتشغيل الهلام، قم بتوصيل مصدر الطاقة بالخلية وتشغيله بتيار ثابت قدره 30 mA لهلام لوحي بسمك 1.5 mm.بعد وصول صبغة التتبع مينتول بلو إلى أسفل هلام الفصل، افصل مصدر الطاقة. والآن بعد اكتمال عملية الفصل الكهربائي، تخلص من منظم الفصل الكهربائي وأزل غرفة المنظم العلوية مع شطيرة الهلام الملحقة بها. قم بتوجيه الهلام بحيث يكون ترتيب آبار العينات معروفاً.بعد ذلك، أخرج الشريحة (sandwich) من غرفة المحلول المنظم العلوية وضعها على ورقة ماصة أو مناشف ورقية. ثم ببطء، قم بسحب أحد الفواصل لمسافة نصف طوله من حافة الشريحة على امتداد طولها بالكامل. استخدم الفاصل المكشوف كرافعة لفتح اللوح الزجاجي، مما يؤدي إلى كشف الهلام بعناية.قم بإزالة الهلام من اللوحة السفلية. اقطع مثلثًا صغيرًا من إحدى زوايا الهلام لضمان عدم فقدان توجيه المسارات أثناء الصبغ والتجفيف. وبذلك تكون عملية الرحلان الكهربائي للهلام قد اكتملت.يمكن الآن معالجة الهلام باستخدام إجراءات مختلفة للكشف عن البروتين. لقد عرضنا لك للتو كيفية فصل البروتينات باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. وهذا كل شيء.شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

يوضح هذا الفيديو تقنية فصل قائمة على بولي أكريلاميد لتغيير طبيعة البروتينات. تساعد هذه التقنية في التحديد الأولي للبروتينات بناء على أوزانها الجزيئية.

الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد دوديسيل كبريتات الصوديوم لتحليل البروتين: تقنية لفصل البروتينات وتصورها بناء على الوزن الجزيئي

يصف هذا الفيديو صفحة متعددة الطبقات لفصل مجمعات البروتين الأصلية عن متجانسات الأنسجة. هذه التقنية عبارة عن مزيج من تقنيات PAGE الأصلية الزرقاء و SDS-PAGE. يمكن وصف المجمعات المنفصلة ودراستها لدورها في عمل الخلية.

Multimer-PAGE لفصل مجمعات البروتين الأصلية: تقنية فصل هجينة تتكون من Blue Native-PAGE و SDS-PAGE لفصل البروتينات متعددة المستويات السليمة عن محللة الأنسجة

&lt; p class = "jove_content"&gt;في هذا الفيديو ، نوضح طريقة الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد التي تفصل البروتينات الفردية عن خليط بروتيني معقد يتم الحصول عليه من أنسجة الورم الورمي الحميد النخامي البشري غير الوظيفي (NFPA). يتم فصل البروتينات بناء على شحنتها الكهربائية في البعد الأول ويتم فصلها بشكل أكبر بناء على الأوزان الجزيئية في البعد الثاني.

الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد ثنائي الأبعاد: تقنية فصل لتحليل البروتينات في خليط البروتين المركب بناء على الشحنة والوزن الجزيئي

يصف هذا البروتوكول  كيفية تحضير وإجراء الرحلان الكهربائي لانحباس الكسر السائل الأصلي الواضح (CN-GELFrEE) ، وهي تقنية فصل أصلية للتجميعات الجزيئية الحيوية غير التساهمية والبروتينات من العينات غير المتجانسة المتوافقة مع تقنيات تحليل البروتين النهائية المختلفة.

CN-GELFrEE - واضح الأصلية جل مزال-جزء السائل الفخ الكهربائي

بعد الانفصال من جانب وسائل الكهربي ، ويمكن الكشف عن البروتينات في هلام بطرق عدة تلطيخ. وأظهرت تلطيخ من البروتينات مع الأزرق Coomassie ، وتلطيخ فضة ، أورانج SYPRO ، روبي SYPRO في هذا الفيديو.

تلطيخ البروتينات في الهلام

ويستخدم على نطاق واسع لطباعة Microcontact نمط البروتينات والجزيئات الأخرى على السطوح المادية. نحن لشرح الخطوات الأساسية لهذه العملية ، وختم أنماط فبرونيكتين على الزجاج.

الطبعة Microcontact من البروتينات لبيولوجيا الخلية

مطلوبة فصل التزاوج والرباعيات للتحليل الجيني...

وفصل التزاوج من الرباعيات المتلحفة reinhardtii عن التحليل الوراثي

وكانت الفئران المعزولة من اللجان الدائمة وfemurs tibias وإثراء ثم فرز الخلايا المغناطيسية. وتأكدت الخلايا فرز للتعبير عن السطح علامات التدفق الخلوي. وكانت أيضا هذه الخلايا المستزرعة في كثافة نسيلي لتشكيل المستعمرات واحدة ثم تم فصل هذه المستعمرات التي اسطوانات الاستنساخ.

العزلة والإثراء من خلايا فأر الجذعية الوسيطة (MSCS) والفصل بين مستعمرة واحدة مشتقة اللجان الدائمة

البروتوكولات وصف الخطوات الضرورية للحصول على بلورات حيود نوعية من البروتين غشاء بدءا من إعادة تشكيل البروتين في مرحلة مكعب lipidic (LCP) ، وإيجاد الظروف الأولية مع فحوصات ما قبل تبلور LCP - FRAP ، وإقامة محاكمات تبلور LCP الحصاد والبلورات .

بلورة البروتينات في الغشاء Mesophases Lipidic

كالمودولين (CAM) المنسدلة مقايسة هو وسيلة فعالة لتحقيق التفاعل بين كام مع البروتينات المختلفة. يستخدم هذا الأسلوب CAM - sepharose الخرز لتحليل كفاءة والمحددة للكاميرا ملزم البروتينات. وهذا يوفر أداة مهمة لاستكشاف إشارات كاميرا في وظيفة الخلوية.

المنسدلة من كالمودولين ملزم البروتينات

تعلم تقنية الفصل الكهربائي للبروتينات باستخدام هلام البولي أكريلاميد (PAGE) لفصل البروتينات حسب الشحنة والحجم. هذه الطريقة تساعد الباحثين في تحليل البروتينات بدقة عالية.

الكهربي فصل البروتينات

استكشف المزيد من الفيديوهات