تلطيخ البروتينات في الهلام

في فيديو سابق بعنوان الفصل الكهربائي للبروتينات، عرضنا كيفية فصل خليط معقد من البروتينات باستخدام الفصل الكهربائي للهلام. في هذا الفيديو، سنعرض لكم أربع طرق مختلفة لصبغ الهلام بهدف رؤية مواقع البروتينات في الهلام. مرحباً، أنا شون غالاغر من شركة UVP، وأعمل مع مركز البروتيوميات هنا في معهد KEG للدراسات العليا.

سأعرض لكم اليوم عدداً من التقنيات المستخدمة لتصوير البروتينات بعد فصلها عن طريق الرحلان الكهربائي. يتضمن ذلك صبغ Coomassie blue والصبغ الفضي، وSypro orange وSypro ruby. لذا، دعونا نبدأ أولاً بصبغة Coomassie blue.

يعتمد الكشف عن حزم البروتين في الهلام عن طريق صبغ Coomassie blue على الارتباط غير النوعي لصبغة معينة. وفي هذه الحالة، تُستخدم صبغة Coomassie brilliant blue G-250. وفي هذه الطريقة، تُغسل البروتينات المفصولة في هلام polyacrylamide باستخدام مياه عالية النقاء.

يتم بعد ذلك تحديد موقع البروتينات باستخدام صبغة kamasi blue ذات أساس مائي. تبلغ حد الكشف من 0.3 إلى 1 µg لكل حزمة بروتينية. للبدء، ابدأ بهلام poly acrylamide تم فيه فصل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي.

بينما يتم التحريك ببطء، ضع هلام البولي أكريلاميد في حاوية بلاستيكية مملوءة بـ 300 milliliters من الماء عالي النقاء. اتركه لمدة خمس دقائق. تخلص من الماء وكرر العملية مرتين إضافيتين بعد الغسلة الثالثة.

قم بسكب الماء وغطِّ الهلام بمحلول صبغ Coomassie blue لمدة ساعة واحدة مع التحريك ببطء. وبعد مرور ساعة من الصبغ، قم بسكب محلول الصبغ. اشطف الهلام لفترة وجيزة عن طريق وضعه في حوالي 200 milliliters من الماء لمدة 30 دقيقة. وفي هذه المرحلة، يمكن تخزين الهلام في الماء من أجل التصوير لاحقاً.

يمكن أيضاً تجفيف الهلام في هذه المرحلة للحفاظ على سجل دائم للهلام. وللقيام بذلك، يوضع الهلام على ورقتين من ورق ترشيح Watman بسمك 3 mm ويغطى الجزء العلوي بغطاء بلاستيكي. ثم يجفف في مجفف هلام تقليدي لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين عند درجة حرارة 80 °C تقريباً.

تتمثل طريقة أخرى لصبغ البروتين في الصبغ بالفضة، والتي سنقوم بتوضيحها تالياً. ورغم أن طريقة الصبغ بـ Kamasi blue أسهل وأسرع، إلا أن الصبغ بالفضة أكثر حساسية بشكل ملحوظ، حيث يصل حد الكشف فيها إلى 0.3 nanograms BSA. ويعتمد الكشف عن حزم البروتين في الهلام عن طريق الصبغ بالفضة على ارتباط الفضة بمجموعات كيميائية مختلفة في البروتين.

يعتمد البروتوكول التالي على مجموعة صبغ الفضة Silver Quest من شركة Invitrogen. وقد اشتُق هذا البروتوكول من بروتوكول الصبغ السريع، والذي يستغرق حوالي 30 دقيقة، وهو يمثل واحدة من العديد من الكيميائيات القائمة على المجموعات الجاهزة المستخدمة في صبغ الفضة والمتوافقة مع مطياف الكتلة. وفي هذه الحالة، سنستخدم هلام mini gel مسبق الصب من شركة Invitrogen قبل البدء في عملية صبغ الفضة.

تأكد من ارتداء القفازات في جميع الأوقات لتجنب التلوث ببصمات الأصابع. ضع الهلام في صينية آمنة للاستخدام في الميكروويف مع 100 milliliters من الماء بدرجة نقاء كاشفية. اشطف الهلام سريعاً ثم اسكب الماء.

بعد ذلك، أضف 100 milliliters من المثبت، المكون من 40%ethanol و10%acetic acid في ماء عالي النقاء، ثم ضعه في الميكروويف لمدة 30 seconds. تعمل عملية الميكروويف على تقصير خطوات الحضن اللازمة من خلال تسريع عملية الارتباط والتلوين. عند هذه النقطة، ضع الهلام على جهاز هزاز ورجّه ببطء لمدة خمس minutes.

بعد مرور خمس دقائق، قم بتصريف المثبت، ثم أضف 100 milliliters من 30%ethanol لغسل الهلام، وضعه في الميكروويف لمدة 30 seconds، ثم ضع الهلام على جهاز الهزاز لمدة خمس دقائق. بعد مرور خمس دقائق، قم بتصريف الـ ethanol. الآن أضف 100 milliliters من كاشف التحسيس، وضعه في الميكروويف لمدة 30 seconds، ثم ضعه على جهاز الهزاز لمدة دقيقتين.

بعد مرور دقيقتين، قم بتصريف كاشف التحسيس. أضف 100 milliliters من الماء بدرجة نقاء كيميائية، وسخنه في الميكروويف لمدة 30 seconds، ثم ضعه على جهاز الرج لمدة دقيقتين. قم بتصريف السائل وكرر العملية لإكمال دورتي غسيل إجمالاً.

الآن أضف 100 milliliters من محلول التلوين، ثم استخدم الميكروويف لمدة 30 seconds وقم بالرج ببطء لمدة خمس دقائق. بعد مرور الخمس دقائق، اسكب محلول التلوين للتخلص منه. أضف 100 milliliters من الماء بدرجة نقاء كاشفية (reagent grade water)، وتجاوز خطوة الميكروويف، وضع العينة مباشرة على جهاز هزاز لمدة تتراوح من 20 إلى 60 seconds.

تخلص من الماء وأضف فوراً 100 milliliters من محلول الإظهار، واستمر في عملية الإظهار حتى تصبح حزم البروتين مرئية. سيستغرق ذلك ما يقرب من خمس إلى 10 دقائق مع بقاء الخلفية صافية. عند هذه النقطة، أضف 10 milliliters من محلول الإيقاف إلى محلول الإظهار لوقف العملية لضمان الحصول على أفضل النتائج.

قم بتصوير الهلام في أسرع وقت ممكن، حيث قد تطرأ تغيرات طفيفة في كثافة اللون وزيادات في عناصر الخلفية غير النوعية. وبمرور الوقت، يحتوي الهلام الذي تراه على بروتينات متبقية. بعد عملية النقل الكهربائي، جفف الهلام للحفاظ على سجل دائم أو خزنه في كيس بلاستيكي قابل للإغلاق. بعد ذلك، سنوضح طريقة لصبغ الهلام فلورياً.

تتمتع الأصباغ الفلورية بعدد من المزايا مقارنة بصبغات البروتين التقليدية. ويمكن لصبغات هلام البروتين Cipro orange، التي سنوضحها هنا، الكشف عن واحد إلى اثنين نانوغرام من البروتين لكل حزمة. وتعد هذه الطريقة أكثر حساسية من صبغ kamasi brilliant blue، وبنفس مستوى حساسية العديد من تقنيات الصبغ بالفضة.

تعد عملية الصبغ الفلوري مباشرة وتتطلب وقتاً أقل في التنفيذ اليدوي مقارنة ببروتوكولات صبغ الفضة التقليدية، وتكتمل في أقل من ساعة واحدة. ويمكن تصور البروتينات المصبوغة باستخدام جهاز عرض الأشعة فوق البنفسجية القياسي بطول موجي 300 nanometer أو ماسح ضوئي بالليزر. وفي هذه الحالة، سنستخدم مرة أخرى هلام mini gel مسبق الصب من شركة in vitrogen للبدء في تحضير وفصل البروتينات باستخدام تقنية SDS page.

ولكن استخدم 0.05%SDS في منظم التشغيل (running buffer) بدلاً من 0.1%SDS المعتادة لتقليل الفلورة الخلفية. لبدء إجراء التصبيغ، صب محلول تصبيغ cipro orange الفلوري في طبق بلاستيكي صغير يتسع لهلامين صغيرين (mini gels) بالحجم القياسي أو هلام واحد. استخدم حوالي 50 milliliters من محلول التصبيغ.

من المهم ملاحظة وجوب تنظيف أطباق الصبغ وشطفها جيداً قبل الاستخدام، حيث إن أي مواد منظفة ستتداخل مع عملية الصبغ. الآن، ضع الهلام في محلول الصبغ. غطِّ الوعاء بورق الألومنيوم لحماية الصبغة من الضوء الساطع.

قم برج الهلام بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح بين 40 إلى 60 دقيقة. تخلص من محلول الصبغ ثم اشطف الهلام لمدة تقل عن دقيقة واحدة باستخدام 7.5%acetic acid، بكمية تبلغ حوالي 100 milliliters لإزالة الصبغة الزائدة من سطح الهلام، ثم احتفظ بالهلام عن طريق تحضينه طوال الليل في 0.1%tween 20 لتصور وتصوير حزم البروتين. ضع الهلام المسمى فلورياً مباشرة على جهاز transluminator قياسي بقدرة 300 nanometer أو جهاز transluminator يعمل بالضوء الأزرق.

بعد ذلك، سنقوم باستعراض طريقة صبغ فلورية بديلة، تستخدم صبغة Cipro ruby الفلورية. وقد صُممت طريقة الصبغ بـ Cipro ruby خصيصاً للاستخدام في الفصل الكهربائي ثنائي الأبعاد، ولكن ثبت أنها الأكثر حساسية لصبغ هلام البروتين في الفصل الكهربائي أحادي الأبعاد التقليدي باستخدام SDS page. للبدء، انقل الهلام إلى طبق نظيف من مادة البولي بروبيلين أو PVC وبحجم مناسب.

قم بتحضين الهلام في كمية مناسبة من صبغة البروتين "cipro ruby" غير المخففة مع التحريك اللطيف والمستمر باستخدام هزاز مداري بسرعة 50 RPMs. قم بتغطية الهلام وتحضينه لمدة ثلاث ساعات على الأقل. انقل الهلام إلى وعاء تلوين نظيف واغسله مرة واحدة في محلول مكون من 10%methanol و 7%acetic acid، ثم استعِد الهلام وضعه مرة أخرى على الهزاز لمدة 30 دقيقة.

من أجل تقليل الفلورة الخلفية وزيادة الحساسية، أصبح الهلام الآن جاهزاً للفحص والتصوير. أود أن أشكركم على متابعة بروتوكولات اليوم. لقد استعرضنا مجموعة من الإجراءات المختلفة لتصور البروتينات بعد عملية الرحلان الكهربائي.

تعد بعض هذه الطرق حساسة للغاية، مثل التلوين الفلوري والتلوين بالفضة، بينما تُعتبر بعضها طرقاً روتينية مثل تلوين Coomassie blue. ومن المهم تذكر أن نقاء الكواشف أمر بالغ الأهمية، كما أن استخدام الماء فائق النقاء ضروري جداً، وكذلك الالتزام بالتوقيت المحدد لكل خطوة من الخطوات.

يجب عليك إيلاء اهتمام وثيق بذلك من أجل الحصول على نتائج قابلة للتكرار أيضاً. هذا كل شيء، وبالتوفيق في مجموعتك القادمة من التجارب.