تلطيخ البروتينات في الهلام
July 8th, 2008
بعد الانفصال من جانب وسائل الكهربي ، ويمكن الكشف عن البروتينات في هلام بطرق عدة تلطيخ. وأظهرت تلطيخ من البروتينات مع الأزرق Coomassie ، وتلطيخ فضة ، أورانج SYPRO ، روبي SYPRO في هذا الفيديو.
في مقطع فيديو سابق بعنوان الفصل الكهربائي للبروتينات ، أوضحنا كيف يمكن فصل خليط معقد من البروتينات باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام. في هذا الفيديو ، سنعرض لك أربع طرق مختلفة لتلوين الجل لتصور موقع البروتينات في الجل. مرحبا ، أنا شون غالاغر من UVP أعمل مع مركز البروتينات هنا في معهد KEG للدراسات العليا.
سأعرض لكم اليوم عددا من التقنيات لتصور البروتينات بعد الانفصال عن طريق الرحلان الكهربائي. وهذا يشمل تلطيخ الفضة الزرقاء كاماسي والبرتقال السيرو والياقوت السيرو. لذلك دعونا نبدأ مع Kamasi blue First.
يعتمدالكشف عن حظر البروتين في الجل عن طريق تلطيخ Kamasi الأزرق على الارتباط غير المحدد للصبغة. في هذه الحالة ، Kamasi الأزرق اللامع G اثنين 50. في هذه الطريقة ، يتم غسل البروتينات المنفصلة في هلام بولي أكريلاميد باستخدام ماء عالي النقاء.
ثم يتم الكشف عن موقع البروتينات باستخدام بقعة كاماسي الزرقاء ذات الأساس المائي. حد الكشف هو 0.3 إلى ميكروغرام واحد لكل نطاق بروتين. للبدء ، ابدأ بهلام بولي أكريلاميد حيث تم فصل البروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي.
أثناء التقليب ببطء ، ضع جل بولي أكريلاميد في وعاء بلاستيكي مملوء ب 300 مل من الماء عالي النقاء. اتركيه لمدة خمس دقائق. تخلص منها وكرر مرتين أخريين بعد الغسيل الثالث.
اسكب الماء وقم بتغطية الجل بمحلول تلطيخ أزرق كاماسي لمدة ساعة واحدة أثناء التقليب ببطء بعد ساعة واحدة من التلوين ، اسكب محلول التلوين. اشطف الجل لفترة وجيزة عن طريق وضع حوالي 200 مل من الماء لمدة 30 دقيقة. في هذه المرحلة ، يمكن تخزين الجل في الماء للتصوير في المستقبل.
يمكن أيضا تجفيف الجل في هذه المرحلة للحفاظ على سجل هلام دائم. للقيام بذلك ، ضع الجل على ورقتين من ورق الترشيح Watman بثلاثة مم وقم بتغطية الجزء العلوي بغلاف بلاستيكي. ثم يجف في مجفف جل تقليدي لمدة ساعة إلى ساعتين عند حوالي 80 درجة مئوية.
طريقة أخرى لتلوين البروتين هي تلطيخ الفضة ، والتي سنوضحها بعد ذلك. على الرغم من أن طريقة تلطيخ Kamasi الأزرق أسهل وأكثر سرعة ، إلا أن تلطيخ الفضة أكثر حساسية إلى حد كبير مع حد اكتشاف يبلغ 0.3 نانوجرام BSA. يعتمد الكشف عن عصابات البروتين في الجل عن طريق تلطيخ الفضة على ارتباط الفضة بمجموعات كيميائية مختلفة في البروتين.
يعتمد البروتوكول التالي على مجموعة تلطيخ Silver Quest الفضية من Vitrogen. البروتوكول مشتق من بروتوكول التلوين السريع ، حوالي 30 دقيقة ويمثل أحد الكيمياء العديدة القائمة على المجموعة المستخدمة في تلطيخ الفضة المتوافق مع قياس الطيف الكتلي. في هذه الحالة ، سنستخدم جل صغير جاهز الصب في vitrogen قبل البدء في تلطيخ الفضة.
تأكد من ارتداء القفازات في جميع الأوقات لتجنب تلوث بصمات الأصابع. ضع الجل في صينية آمنة للاستخدام في الميكروويف مع 100 مل من ماء الكاشف. شطف لفترة وجيزة ثم صب الماء.
بعد ذلك ، أضف 100 مل من المثبت ، يتكون من 40٪ إيثانول ، 10٪ حمض الأسيتيك في ماء عالي النقاء والميكروويف لمدة 30 ثانية. تعمل عملية الميكروويف على تقصير خطوات الحضانة اللازمة عن طريق تسريع الربط والتلطيخ. في هذه المرحلة ، ضع الجل على شاكر وقم بتأرجح ببطء لمدة خمس دقائق.
بعد خمس دقائق ، اسكب المثبت ، أضف 100 مل ، 30٪ إيثانول لغسل الميكروويف لمدة 30 ثانية ، ثم ضع الجل على شاكر لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، اسكب الإيثانول. أضف الآن 100 مل من كاشف الميكروويف المحسس لمدة 30 ثانية ، ثم ضعه على شاكر لمدة دقيقتين.
بعد دقيقتين ، اسكب الكاشف الحساس. أضف 100 مل من الماء في الميكروويف لمدة 30 ثانية ، وضعها على شاكر لمدة دقيقتين. اسكبيها وكرري العملية لمدة دورتين غسيلتين.
أضف الآن 100 مل من محلول التلوين ، والميكروويف لمدة 30 ثانية وحركه ببطء لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق ، اسكب محلول التلوين. أضف 100 مل من الماء من درجة الكاشف ، وتخطي الميكروويف ، وخطو وضعه مباشرة على شاكر لمدة 20 إلى 60 ثانية.
تخلص من الماء وأضف على الفور 100 مل من المحلول النامي وقم بتطويره حتى تصبح عصابات البروتين مرئية. مع بقاء الخلفية واضحة ، سيستغرق ذلك حوالي خمس إلى 10 دقائق. في هذه المرحلة ، أضف 10 ملليلتر من محلول السدادة إلى المطور لإيقاف التطوير للحصول على أفضل النتائج.
قم بتصوير الجل في أسرع وقت ممكن حيث قد تكون هناك تغييرات طفيفة في شدة اللون وزيادة في عناصر الخلفية غير المحددة. بمرور الوقت ، يحتوي الجل الذي تراه على بروتينات متبقية بعد النشاف الكهربائي ، جفف الجل للحفاظ على سجل دائم أو قم بتخزينه في كيس بلاستيكي قابل للغلق. بعد ذلك ، نوضح طريقة لتلطيخ المواد الهلامية بالفلورسنت.
تتمتعالأصباغ الفلورية بعدد من المزايا مقارنة ببقع البروتين التقليدية. يمكن لبقع هلام البروتين البرتقالي Cipro ، والتي سنحددها هنا ، اكتشاف واحد إلى نانوغرامين من البروتين لكل فرقة. هذا أكثر حساسية من تلطيخ كاماسي الأزرق اللامع وحساس مثل العديد من تقنيات تلطيخ الفضة.
تلطيخ الفلورسنت بسيط مع وقت أقل من بروتوكولات تلطيخ الفضة النموذجية ويكتمل في أقل من ساعة واحدة. يمكن تصور البروتينات الملونة باستخدام جهاز الأشعة فوق البنفسجية القياسي 300 نانومتر أو ماسح ضوئي بالليزر. في هذه الحالة ، سنستخدم مرة أخرى جل صغير جاهز الصب في vitrogen لبدء تحضير البروتينات وفصلها باستخدام صفحة SDS.
لكن استخدم 0.05٪ SDS في المخزن المؤقت قيد التشغيل بدلا من 0.1٪ SDS المعتاد لتقليل مضان الخلفية. لبدء إجراء التلوين ، اسكب محلول تلطيخ الفلورسنت البرتقالي cipro في طبق بلاستيكي صغير لواحد أو اثنين من المواد الهلامية الصغيرة ذات الحجم القياسي. استخدم حوالي 50 مل من محلول التلوين.
منالمهم ملاحظة أنه يجب تنظيف أطباق التلوين وشطفها جيدا قبل الاستخدام لأن أي منظفات ستتداخل مع التلوين. الآن ، ضع الجل في محلول التلوين. قم بتغطية الحاوية بورق الألمنيوم لحماية الصبغة من الضوء الساطع.
حرك الجل برفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 إلى 60 دقيقة. تخلص من محلول التلوين ثم اشطف الجل لمدة تقل عن دقيقة واحدة بحمض الأسيتيك 7.5٪ ، حوالي 100 مل لإزالة البقعة الزائدة من سطح الجل ، واحتجز الجل عن طريق احتضانه طوال الليل في 0.1٪ tween 20 لتصور وتصوير عصابات البروتين. ضع الجل المصنف بالفلورسنت مباشرة على جهاز مضيء قياسي 300 نانومتر أو محول إضاءة أزرق.
بعد ذلك ، سنوضح طريقة تلطيخ الفلورسنت البديلة ، والتي تستخدم صبغة الفلورسنت Cipro ruby. تم تصميم طريقة تلطيخ الياقوت Cipro خصيصا للاستخدام في صفحة ثنائية الأبعاد ، ولكنها أثبتت أنها صبغة هلام البروتين الأكثر حساسية لصفحة SDS القياسية أحادية البعد. للبدء ، نقل الجل إلى طبق بولي بروبيلين أو PVC نظيف بالحجم المناسب.
احتضن الجل في الكمية المناسبة من صبغة هلام بروتين سيبرو روبي غير المخففة مع تحريك لطيف مستمر على شاكر مداري بسرعة 50 دورة في الدقيقة. انقل الجل إلى طبق تلطيخ نظيف واغسله مرة واحدة في محلول حمض الأسيتيك بنسبة 10٪ من الميثانول و 7٪ ، واسترجع الجل وضعه مرة أخرى على الكرسي الهزاز لمدة 30 دقيقة.
من أجل تقليل تألق الخلفية وزيادة الحساسية ، أصبح الجل جاهزا الآن للعرض والتصوير. أود أن أشكركم على مشاهدة بروتوكولات اليوم لقد أظهرنا لك عددا من الإجراءات المختلفة لتصور البروتينات بعد الرحلان الكهربائي.
بعضها حساس للغاية ، مثل تلطيخ الفلورسنت وتلوين الفضة ، وبعضها روتيني مثل تلطيخ كاماسي الأزرق. من المهم أن تتذكر أن نقاء الكاشف أمر بالغ الأهمية. يعد استخدام الماء النقي للغاية أمرا مهما أيضا ، وكذلك توقيت كل خطوة من الخطوات.
تحتاج إلى إيلاء اهتمام وثيق لذلك من أجل الحصول على نتائج قابلة للتكرار أيضا. هذا كل شيء ونتمنى لك التوفيق في مجموعتك التالية من التجارب.
نظرة عامة
يُظهر هذا الفيديو طرقًا مختلفة لتلطيخ الجل لتصور البروتينات بعد الفصل الكهربي. تشمل التقنيات الأزرق الكوميسي، التلطيخ بالفضة، SYPRO Orange، وSYPRO Ruby.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الكيمياء الحيوية
- بروتيوميات
- الفصل الكهربي
الخلفية
- الفصل الكهربي على الجل هو طريقة شائعة لفصل البروتينات.
- طرق التلطيخ ضرورية لتصور البروتينات المنفصلة.
- تختلف تقنيات التلطيخ المختلفة في الحساسية وسهولة الاستخدام.
- يبني هذا الفيديو على عروض سابقة لفصل البروتينات.
هدف الدراسة
- لعرض تقنيات التلطيخ المتعددة لتصور البروتين.
- لمقارنة فعالية وحساسية كل طريقة.
- لتوفير دليل عملي للباحثين في علم بروتيوميات.
الطرق المستخدمة
- تلطيخ الأزرق الكوميسي للكشف العام عن البروتين.
- التلطيخ بالفضة لحساسية محسنة في تصور البروتين.
- SYPRO Orange وSYPRO Ruby للكشف الفلوري.
- تشمل البروتوكولات التحضير، التلطيخ، وتصوير الجل.
النتائج الرئيسية
- يوفر الأزرق الكوميسي طريقة سريعة وسهلة للكشف عن البروتين.
- يوفر التلطيخ بالفضة حساسية أعلى، ويستطيع اكتشاف تركيزات البروتين المنخفضة.
- تلطيخات فلورة مثل SYPRO Orange حساسة وتتطلب وقتًا أقل.
- كل طريقة لها مزايا فريدة اعتمادًا على احتياجات البحث.
الاستنتاجات
- تتوفر تقنيات تلطيخ متعددة لتصور البروتين بعد الفصل الكهربي.
- يجب على الباحثين اختيار الطرق بناءً على الحساسية وسهولة الاستخدام.
- فهم هذه التقنيات يعزز تحليل عينات البروتين.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Reliable protein visualization following electrophoretic separation is foundational for early discovery, assay development, and translational workflows in biopharma R&D. The choice of staining method directly impacts sensitivity, reproducibility, and downstream analytical confidence, influencing target validation and screening decisions. Standardized, high-sensitivity staining protocols enable robust data generation and portfolio triage across discovery and preclinical inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Supports detection and quantification of protein targets post-separation for hypothesis testing.
- Enables assessment of protein expression and purity critical for target validation.
- Facilitates mechanistic de-risking by confirming presence and integrity of candidate proteins.
Screening & Assay Development
- Provides validated visualization of proteins for assay standardization and reproducibility.
- Enables selection of staining protocols based on required sensitivity for screening campaigns.
- Supports quantitative comparison of protein bands, informing assay optimization.
Translational & Preclinical Research
- Allows sensitive detection of low-abundance proteins relevant to disease models.
- Ensures continuity of protein analytics from discovery through preclinical validation.
- Reduces risk of false negatives in biomarker or target assessment workflows.
Pipeline & Workflow Integration
Protein staining methods are positioned immediately after electrophoretic separation, bridging discovery biology and analytical workflows. Selection of staining technique informs downstream quantitation, mass spectrometry compatibility, and data reproducibility.
- Discovery Biology: Confirms protein separation and supports null hypothesis testing for target presence.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative band visualization for assay readiness.
- Analytics: Provides sensitivity thresholds and imaging outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains analytical continuity for biomarker and target validation.
- Enterprise Reuse: Standardized protocols enable cross-project and cross-team adoption.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in protein detection.
- Operational Value: Enables reproducible, scalable workflows with clear sensitivity benchmarks.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and efficient resource allocation.
- Portfolio Impact: Enhances risk-adjusted prioritization by ensuring robust protein analytics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophoresis and staining protocol execution.
- Demands access to high-purity reagents, imaging systems, and controlled environments.
- Necessitates strict timing and handling to ensure reproducibility and sensitivity.
- Protocols must be adapted for compatibility with downstream mass spectrometry or fluorescence imaging.
- Attention to reagent purity and protocol timing is critical for consistent results.
