Electroporation من مايكوباكتيريا

لا تزال الاستراتيجيات المسببة للأمراض الفطرية غير مفهومة جيدا لمعدل النمو البطيء لمعظم الأنواع. تجعل الطبيعة التي لا يمكن اختراقها لجدار الخلية ومخاطر العمل مع مسببات الأمراض من الصعب دراسة البكتيريا الفطرية وهي مسؤولة إلى حد كبير عن سوء فهمنا لهذه الكائنات الحية. في هذا الفيديو، سوف نوضح تقنية التثقيب الكهربائي، والتي تتضمن تعريض الخلايا لنبضة كهربائية قصيرة وعالية، مما يسمح بدخول الحمض النووي.

إنها الطريقة الأكثر استخداما لإدخال الحمض النووي في الخلايا الفطرية. مرحبا ، أنا رون جود من مختبر تانيا باريش من مركز الأمراض المعدية في الخفافيش وكلية لندن للطب وطب الأسنان. سنعرض لك اليوم إجراء للبكتيريا الدقيقة التي تعمل بالكهرباء.

في مختبرنا ، ندرس البكتيريا الدقيقة السلية ، ولكن نظرا لأنها شديدة الإمراض وتتطلب مرافق احتواء C3 ، فسوف نعرض لك هذه التقنية في البكتيريا الدقيقة غير المسببة للأمراض m Mcma. لذلك دعونا نأكل بعض البكتيريا بالكهرباء. لأكل البكتيريا الفطرية ، نحتاج إلى تكوين خلايا مختصة.

من المهم أن تتذكر أن البكتيريا الفطرية المسببة للأمراض تمثل خطرا بيولوجيا مهما. لذلك ، يجب إجراء جميع عمليات التلاعب بالثقافة والوراثة في احتواء مناسب. يجب أن يشكل تقييم المخاطر داخل خزانة السلامة من الدرجة الأولى الجزء الأول من أي تجربة مع البكتيريا الفطرية المسببة للأمراض.

لصنع هذه ، نبدأ بالثقافة التي تم الحفاظ عليها في المختبر على وسائط صلبة مثل lemko ، وتلقيح المثقاب ، وخمسة ميل Lemko التي تحتوي على مرق توين مع حلقة مليئة بالبكتيريا الفطرية. نظرا لأن العديد من البكتيريا الفطرية كائنات بطيئة النمو نسبيا ، فمن المهم للغاية الحفاظ على تقنية معقمة جيدة لمنع تلوث هذه الثقافات ببكتيريا الفطريات التي يمكن أن تتفوق بسرعة على البكتيريا الفطرية. غالبا ما يكون من الحكمة إنشاء ثقافات مكررة في حالة تلوث أحدها.

تميل خلايا البكتيريا الفطرية إلى التكتل معا في الثقافة بسبب معطفها الشمعي السميك. تقلل الدوامة وإضافة المنظفات غير الأيونية مثل وسط tween 82 من هذا التكتل وتوفر تعليقا أكثر تجانسا للخلايا. بعد التلقيح ، احتضن المزرعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند مائة دورة في الدقيقة بين عشية وضحاها.

بعد نمو ثقافة البداية ، قم بتلقيح ثقافة واسعة النطاق حوالي مائة ميل من lemko tw في قارورة مخروطية سعة 250 مل مع تخفيف واحد إلى 100 من الثقافة الليلية. استمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز لمدة 16 إلى 24 ساعة ، وفي ذلك الوقت يمكن التحقق من الكثافة البصرية باستخدام مقياس الطيف الضوئي. إذا قرأ 0.8 إلى خلية واحدة في مرحلة السجل المثلى للنمو.

بعد ذلك ، احتضان الخلايا على الجليد لمدة 1.5 ساعة قبل الحصاد ، مما سيساعد على زيادة كفاءة التحويل بمقدار أربعة أضعاف. أطول. تؤدي الحضانات على الجليد إلى انخفاض الكفاءة. بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا عن طريق صب المزارع في أنابيب طرد مركزي كبيرة.

تدور عند 300 جرام لمدة 10 دقائق بعد الطرد المركزي ، اغسل الخلايا ثلاث مرات في البرد المثلج ، ويقلل الجلسرين بنسبة 10٪ من الحجم في كل مرة ، بحيث يتم استخدام 20 وجبة للغسيل الأول ، ثم 10 مل وأخيرا خمسة مل للغسيل الأخير. بعد الغسيل ، يعلق النسخ الخلايا في واحد إلى 10 إلى واحد إلى مائة من الحجم الأصلي للبرد الجليدي. 10٪ جلسرين في هذه المرحلة ، يمكن أن تكون الخلايا متجمدة وتخزينها عند 70 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها في المستقبل.

غالبا ما تزداد كفاءة التحويل بعد تجميد الخلايا. قبل استخدام هذه الخلايا المختصة ، يجب إذابتها وحصادها عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليقها في الجلسرين الطازج بنسبة 10٪ قبل الاستخدام. من أجل العرض الكهربائي ، قم بتشغيل EMS mag an electro ، وهو جهاز يمكنه توصيل نبضة عالية الجهد تبلغ 2.5.

يتم استخدام الكيلو فولت. يتم وضع البكتيريا والحمض النووي في التثقيب الكهربائي ، الكوفيت. وعلى الرغم من أن الفجوة أو طول المسار قد يكون متماثلا في الكوفيتات المختلفة ، إلا أنهما يختلفان فيما يتعلق بالحجم الذي يمكن أن تحمله.

نستخدم بشكل روتيني 200 ميكرولتر من الخلايا في 0.2 سم qve لأكل الخلايا. أولا ، قم بإعداد عينة الحمض النووي بحيث تكون خالية من الأملاح والملوثات الأخرى. هذا مهم لتقليل فرص الانحناء أثناء التثقيب الكهربائي.

قبل اختراق البكتيريا ، تأكد من أن عينات الحمض النووي الخاصة بك عالية النقاء. يجب أن تكون نسبة الامتصاص 60 إلى 80 قريبة من 1.8. أضف 0.5 إلى خمسة ميكروغرامات من الحمض النووي الخالي من الملح في حجم لا يزيد عن خمسة ميكرولتر إلى 200 ميكرولتر معلق ميكروبكتيري ، يمكن تضمين التثقيب الكهربائي للتحكم بدون حمض نووي للتحقق من تواتر طفرات مقاومة المضادات الحيوية.

ثم اترك المزيج على الثلج لمدة 10 دقائق. سيؤدي ذلك إلى تقليل وجود خلايا الحياة في العينة والأملاح في محلول الحمض النووي ، مما يقلل من الانحناء بعد حضانة الجليد ، ويعيد توزيع الخلايا جيدا باستخدام ماصة أو دوامة قبل نبضة الجهد العالي لإعادة تعليق الخلايا وضمان خلط الحمض النووي. أي تكتل للخلايا سيؤدي إلى الانحناء وتقليل كفاءة التحول.

بعد ذلك ، انقل المزيج إلى قطب كهربائي مبرد مسبقا 0.2 سم qb. مرة أخرى ، احرص على عدم إدخال أي فقاعات في المزيج. أيضا لتقليل الانحناء.

تأكد من أن الجزء الخارجي من qve جاف تماما قبل وضعه في حجرة النبض. بعد تجفيف qve جيدا ومع ضبط مقاومة وحدة التحكم في النبض على ألف أوم ، ضع qve في غرفة التثقيب الكهربائي. ثم بعد ضبط الجهد على 2.5 كيلو فولت ، قم بتطبيق النبضة حتى يصاب صوت تنبيه ، مما يشير إلى أن المكثف في QVE قد تم تفريغه.

الثابت الزمني الأكبر من 10 إلى التثقيب الكهربائي الناجح. عادة ما يشار إلى التثقيب الكهربائي غير الناجح عن طريق الانحناء ، مما يتسبب في حدوث شرارة ، والتي يمكن تجنبها في كثير من الأحيان. عن طريق تغيير المقاومة على وحدة التحكم في النبض ، ضع الطبيب البيطري Q مرة أخرى على الجليد لمدة 10 دقائق.

بعد الحضانة ، انقل معلق الخلية إلى زجاجة عالمية معقمة تحتوي على خمسة مل من مرق lemko TW. من المهم تخفيف الخلايا عشرة أضعاف على الأقل بعد النبض مباشرة لمساعدة الخلايا على التعافي وزيادة بقاء المحولات. بعد ذلك ، قم باحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات ، ثم تصبح جاهزة للطلاء بعد الحضانة ، وحصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 3000 جي ثانية لمدة 10 دقائق.

بعد الطرد المركزي ، قم بعمل تخفيف مناسب للتعليق في مرق ليمكو بحيث تحصل كل لوحة على 30 إلى 300 مستعمرة. من المهم التأكد من ظهور مستعمرات مقاومة من خلية واحدة ، لذا تأكد من إعادة تعليق الخلايا تماما قبل الطلاء. إذا لم يتم تخفيف الخلايا ، فقد يكون من الصعب جدا تصور مستعمرات مقاومة حقا على خلفية العشب من الخلايا الحساسة الآن تخرج الخلايا على مثقب ليمكو بالمضاد الحيوي المناسب.

يحتضنون الصفائح عند 37 درجة مئوية حتى تصبح المستعمرات مرئية. سيستغرق هذا من ثلاثة إلى خمسة أيام بعد نمو المستعمرات. عد المحولات.

لحساب كفاءة التحويل. هناك عدة عوامل تؤثر على كفاءة التحول. وتشمل هذه مرحلة نمو الخلايا عند حصاد وسائط التثقيب الكهربائي ، وقوة المجال وثابت الوقت للنبضة التي يتم تسليمها.

تعتمد كفاءة تقنية التثقيب الكهربائي أيضا على اختيار الحمض النووي للتحويل ، وأحيانا على اختيار العلامة القابلة للتحديد. نحصل بشكل روتيني على كفاءات من 10 إلى الخامس ، إلى 10 إلى المستعمرات السادسة لكل ميكروغرام ، الحمض النووي ، باستخدام مقاومة الهيجروميسين أو الستربتومايسين في صهارة EMS. الآن لتنمو المحولات ، قم بإخراج البكتيريا الفطرية المثقبة بالكهرباء إلى وسط صلب بالإضافة إلى الاختيار.

يحتضن المضاد الحيوي عند 37 درجة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام. بعد الحضانة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام ، يمكنك تحليل المحولات كما هو مطلوب لمعظم التطبيقات ، ويجب إخراج ثلاثة محولات وتحليلها. من المهم التحقق من هوية البلازميد الكروموسومي الإضافي بعد التحول.

نظرا لأن عمليات الحذف وإعادة الترتيب شائعة ، فقد أوضحت لك للتو كيفية إلكتروليت الصهارة المتفطرة. إذا كنت ستنفذ هذا الإجراء مع البكتيريا الدقيقة المسببة للأمراض ، فتذكر استخدام تدابير السلامة المناسبة. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.