الماوس البشرة الجذعية العصبية خلية كريست (EPI - NCSC) الثقافات
May 9th, 2008
نعرض هنا لدينا وسيلة لعزل الماوس البشرة الجذعية العصبية قمة الخلايا (EPI - NCSC). الأسلوب الذي ينطوي على تشريح المسام الدقيقة ضئيلة للغاية ، وعزل انتفاخ placeing عليه في زراعة الأنسجة. EPI - NCSC بدء الهجرة من explants انتفاخ على الطبقة التحتية في غضون 3 -- 4 أيام.
مرحبا ، أنا مايا سيبو بلوم من معهد علم الوراثة البشرية ومعهد شمال شرق إنجلترا للخلايا الجذعية في جامعة نيوكاسل. وهذا من كلية الطب في ويسكونسن. سنعرض لك اليوم إجراءاتنا لإعداد Al Explan من بصيلات فيسكو للفئران.
B Explan هي الأنسجة الأولية لإعداد مزارع الخلايا الجذعية للقمة العصبية للبشرة. يتضمن هذا الإجراء تشريح وسادة الشعيرات والتشريح الدقيق لبصيلات الشعر ، ثم عزل BULs ووضعها في صفيحة ثقافة. لذلك دعونا نبدأ.
يبدأ هذا الإجراء بتشريح الانتفاخ من بصيلات شعيرات الفأر البالغة. عادة ، نستخدم الفئران التي يبلغ عمرها شهرين إلى ستة أشهر ، ومع ذلك ، تميل الفئران الأصغر سنا إلى إنتاج المزيد من الخلايا الجذعية. يتم غمر وغمرها بالكامل في خليط فردي من البيتادين وبيروكسيد الهيدروجين لمدة ثلاث دقائق تقريبا للتطهير ، ثم رش الفأر بالكامل ، وخاصة منطقة الوجه ، بنسبة 75٪ من الإيثانول وحمل الفأر إلى المجهر التشريح.
في غطاء التدفق الصفحي ، قم بتشريح وسادات WHI بعناية ، وتجنب تقطيع بصيلات الشعر ووضعها في محلول ملح متوازن معلق في درجة حرارة الغرفة. لتشريح بصيلات مصل اللبن ، أمسك الجلد بجوار المسام بالملقط ثم اقطع حول المسام بمقص مستقيم. قطع بعمق.
لتجنب إصابة بصيلات الشعر ، ارفع بصيلات الشعيرات من وسادة الشعيرات وضعها في طبق جديد. باستخدام HBSS الطازج ، اسحب البصيلات في نفس اللوحة. قم بتثبيت بصيلات الشعر مع ts وإبر حادة على طبق بتري زجاجي مطلي بواقي الحرير يحتوي على HBSS.
اغسل الأنسجة الدهنية الرخوة والأنسجة الجلدية باستخدام نافورات من العازلة حتى تصبح بصيلات الشعيرات نظيفة. إذا لزم الأمر ، قم بقطع العصب إلى جريب الشعيرات وإزالة الأنسجة الملتصقة عن طريق كشط التدفق المتكرر ل HBSS. قطع بصيلات فيسكو طوليا باستخدام شفرة دقيقة.
تجنب القطع بعمق شديد لأن ذلك سيؤدي إلى إصابة الانتفاخ. قم بإزالة أي دم مع الأكياس المتكررة من HBSS حتى تختفي. يعد ظهور الدم مؤشرا جيدا على أن الجرح كان عميقا بدرجة كافية.
بعد ذلك ، قم بعمل قطع عرضي فوق مستوى الجيب التماسي وبعد ذلك قطع عرضي ثان على المستوى داخل الجيب الحلقي بالقرب من الجلد داخل قطعة المسام المعزولة. سترى الآن الانتفاخ داخل الكبسولة. انظر ، ها هو.
أمسك نهاية الكبسولة بالملقط وقم بإزالة الانتفاخ. سترى الآن الكبسولة الفارغة وبركة الانتفاخ المعزولة. انتفاخات معزولة في لوحة ثقافة منفصلة في HBSS في درجة حرارة الغرفة.
تأكد من عدم وجود أنسجة أخرى تلوث الانتفاخات المجمعة. في هذه المرحلة ، يمكن استزراع النباتات المنتفخة قبل الاستزراع في نباتات البول. يتم طلاء ألواح الثقافة مقاس 35 ملم بالكولاجين عن طريق وضع قطرات من 50 ميكرولتر من الكولاجين و 10 ميكرولتر معقمة.
6٪ محلول ملحي بجانب بعضهما البعض. تخلط جيدا باستخدام ماصة ملصق مزدوجة الانحناء وتدفع نحو حافة لوحة الثقافة ، وتحتضن طوال الليل في بيئة نظيفة ولكن لا تتركها تجف. نستخدم مجففا مع طبق من الماء في الأسفل لهذا الغرض.
في اليوم التالي ، يوم الثقافة. اشطف الأطباق بألواح مزرعة ملحية ومحتضنة مسبقا ومغلفة بالكولاجين ومغسولة لمدة ثلاث ساعات تقريبا. مع وسط الاستزراع في وسط الاستزراع يتكون من 85٪ MEM معدل ألفا ، و 10٪ مصل بقري جنين ، و 5٪ مستخلص جنين كتكوت يوم 11.
بعد الحضانة المسبقة ، قم بإزالة وسط الاستزراع من الأطباق وأضف العديد من BULs بأقل قدر ممكن من المتوسط. قم بإزالة وسط الثقافة الزائد. احتضان لمدة ساعة في حاضنة الخلايا في جو مرطب مع 10٪ أكسجين و 5٪ CO2.
بعد ساعة واحدة ، أضف ببطء 1.5 مل من الثقافة. يجب أن تلتصق نباتات CHE المتوسطة بالطبقة السفلية للكولاجين تحل محل 50٪ من الوسط الثقافي يوميا. حسنا ، الآن دعنا نذهب.
والآن نظرة على الثقافات. في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام ، ستهاجر الخلايا شديدة الارتحال من فحوصات الكرة. تلاحظ النباتات مورفولوجيتها النجمية وغياب السائد لملامسات الخلايا الخلوية.
خلال الأيام القليلة المقبلة ، ستهاجر المزيد من الخلايا وستتكاثر الخلايا المهاجرة بسرعة الخلايا النادرة المهمة ذات التشكل المسطح ، والتي تصبح واضحة أحيانا بعد عدة أيام من القمة العصبية للبشرة. تظهر الخلايا الجذعية أحيانا في هذه الثقافات. هذه الخلايا ليست خلايا جذعية للقمة العصبية للبشرة ، ولكنها بدلا من ذلك أقل حركة أو مفترضة أو خلايا جذعية للبشرة أو مزارع أسلاف يجب التخلص منها.
لقد أوضحنا لك للتو كيفية تحضير ثقافات البلاط التي تحتوي على الخلايا الجذعية العصبية العصبية للبشرة. نظرا لأن الخلايا العصبية مهاجرة للغاية ، فإنها ستترك البلش في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام. بعد الشرح ، تتم إزالة الانتفاخ ويبقى السكان النقيون للخلايا العصبية في لوحة الثقافة.
عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تطهير الماوس بعناية لتجنب التلوث. يجب على المرء أيضا أن يخفض بعمق في خطر الوسادة حتى لا يؤذي خطر الإصابة بالبصيلات. فيما يتعلق بالثقافات ، من المهم التفريق بين نواتج التقطير المهاجرة ، وخلايا القمة العصبية ، والخلايا الكيراتينية غير المهاجرة على شكل حصى.
هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
المراجع
تقدم هذه المقالة طريقة لعزل الخلايا الجذعية القمية من قمة بصيلات الشعيرات لدى الفئران من بصيلات الشعيرات. تتضمن التقنية تشريح بصيلات الشعيرات بالميكروسكوب، وعزل التورم، ووضعه في مزرعة الأنسجة، حيث تبدأ الخلايا الجذعية القمية بالهجرة خلال 3 إلى 4 أيام.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- بيولوجيا الخلايا الجذعية
- تقنيات زراعة الخلايا
الخلفية
- الخلايا الجذعية القمية الجلدية مهمة للعديد من العمليات التنموية.
- تقنيات العزل ضرورية لدراسة هذه الخلايا في المختبر.
- تعمل بصيلات الشعيرات كمصدر غني للخلايا الجذعية القمية الجلدية.
- يمكن أن يوفر فهم سلوك الخلايا الجذعية القمية الجلدية رؤى حول التطور العصبي.
غرض الدراسة
- تطوير طريقة موثوقة لعزل الخلايا الجذعية القمية الجلدية.
- تسهيل دراسة خصائص الخلايا الجذعية القمية.
- تعزيز فهم هجرة الخلايا الجذعية وزراعتها.
الطرق المستخدمة
- تشريح بصيلات الشعيرات من الفئران بالميكروسكوب.
- عزل التورم من البصيلات.
- وضع أنسجة التورم في أطباق مزرعة الأنسجة.
- مراقبة هجرة الخلايا على مدى عدة أيام.
النتائج الرئيسية
- نجحت الخلايا الجذعية القمية الجلدية في الهجرة من أنسجة التورم.
- لوحظت هجرة الخلايا خلال 3 إلى 4 أيام بعد المزرعة.
- ثبت أن الطريقة فعالة لعزل الخلايا الجذعية القابلة للحياة.
- تدعم النتائج المزيد من البحث في تطبيقات الخلايا الجذعية القمية الجلدية.
الاستنتاجات
- الطريقة الموضحة هي نهج قابل للتطبيق لعزل الخلايا الجذعية القمية الجلدية.
- يمكن للدراسات الإضافية استكشاف الخصائص الوظيفية لهذه الخلايا.
- قد تساعد هذه التقنية في فهم تطور القمة العصبية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Isolation of epidermal neural crest stem cells (EPI-NCSC) from adult whisker follicles provides a reproducible source of multipotent stem cells for target validation and phenotypic screening in neuroscience and regenerative medicine. The method enables mechanistic de-risking by yielding a pure population of migratory stem cells capable of differentiating into neural, mesenchymal, and pigment lineages. This supports early discovery workflows requiring disease-relevant systems with defined cellular outputs for lead identification and predictive confidence in target engagement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neural crest-derived lineages for target hypothesis testing in peripheral nervous system and mesenchymal pathways.
- Operational Value: Provides a highly pure, accessible stem cell population from adult tissue, reducing variability in early-stage target validation assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Yields migratory EPI-NCSC with stellate morphology and rapid proliferation, suitable for quantitative readouts in compound screening.
- Operational Value: Standardized isolation from whisker follicles supports assay reproducibility and scalability across discovery campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Differentiation potential into neurons, smooth muscle, bone/cartilage, and melanocytes enables disease-relevant modeling of neuropathies, fibrosis, and pigment disorders.
- Operational Value: Emigration within 3–4 days allows timely expansion for preclinical mechanistic studies and biomarker screening.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing a disease-relevant system for assessing target engagement and pathway modulation in neural crest-derived lineages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on multipotent stem cell differentiation and lineage specification in neural crest pathways.
- Screening: Delivers standardized, migratory cell outputs with defined morphology and proliferation kinetics for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative measurement of emigration rates, proliferation, and differentiation markers as dependent variables in screening assays.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through differentiation into functional cell types relevant to neural, mesenchymal, and dermal pathologies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform for multiple target classes across neuroscience, fibrosis, and regenerative medicine portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through multipotent differentiation capacity and defined migratory phenotype.
- Operational Value: Standardized bulge isolation and collagen-coated culture ensure reproducibility and low contamination risk.
- Strategic Value: Enables early go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neural crest-associated targets.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on stem cell-derived phenotypic responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in micro-dissection and sterile tissue culture techniques.
- Dependent on collagen-coated plates and specific culture medium containing chick embryo extract.
- Necessitates standardized disinfection and follicle isolation protocols to ensure bulge purity.
- Adaptation to other follicle types may require optimization of dissection parameters.
- Limited to murine sources; human applicability would require validation of analogous bulge structures.
