الماوس البشرة الجذعية العصبية خلية كريست (EPI - NCSC) الثقافات

مرحباً، أنا مايا سيبو بلوم من معهد الوراثة البشرية ومعهد شمال شرق إنجلترا للخلايا الجذعية بجامعة نيوكاسل. وهذا الزميل من كلية الطب في ويسكونسن. سنعرض لكم اليوم إجراءنا الخاص بتحضير المستنبتات النسيجية (Explan) من الجريبات المبيضية للفئران.

تعتبر أجنة الدجاج (B Explan) هي الأنسجة الأولية لتحضير مستنبتات الخلايا الجذعية العصبية القمية للبشرة. يتضمن هذا الإجراء تشريح وسادة الشوارب والتشريح المجهري لبصيلات الشعر، ثم عزل البصيلات (BULs) ووضعها في طبق استنبات. لذا، فلنبدأ.

تبدأ هذه العملية بتشريح منطقة الانتفاخ (bulge) من بصيلات شارب الفأر البالغ. عادةً ما نستخدم فئرانًا تتراوح أعمارها بين شهرين وستة أشهر، ومع ذلك، تميل الفئران الأصغر سنًا إلى تقديم عدد أكبر من الخلايا الجذعية. يتم تخدير الحيوانات وغمرها بالكامل في خليط بنسبة واحد إلى واحد من Betadine وبيروكسيد الهيدروجين لمدة ثلاث دقائق تقريبًا للتطهير، ثم يتم رش الفأر بالكامل، وخاصة منطقة الوجه، بـ 75% ethanol ونقل الفأر إلى مجهر التشريح.

في غطاء التدفق الصفائحي، قم بتشريح وسادات WHI بعناية، مع تجنب القطع في بصيلات الشعر، ثم ضعها في محلول ملحي متوازن من نوع Hanks في درجة حرارة الغرفة. ولتشريح جريبات whi، أمسك الجلد المجاور للجريب باستخدام الملقط، ثم قص حول الجريب باستخدام مقص مستقيم. قم بالقص بعمق.

لتجنب إصابة بصيلات الشعر، ارفع جريب الشعرة من وسادة الشوارب وضعه في طبق جديد. باستخدام محلول HBSS طازج، اسحب الجريبات في الطبق نفسه. قم بتثبيت جريب شعرة باستخدام ملاقط وإبر مدببة على طبق بتري زجاجي مطلي بواقٍ حريري يحتوي على محلول HBSS.

قم بغسل الأنسجة الدهنية السائبة والأنسجة الجلدية بدفقات من المحلول المنظم حتى تصبح بصيلة الشارب نظيفة. إذا لزم الأمر، اقطع العصب الواصل إلى بصيلة الشارب وقم بإزالة الأنسجة الملتصقة عن طريق الكشط والغسل المتكرر بمحلول HBSS. اقطع بصيلة الشارب طولياً باستخدام شفرة دقيقة.

تجنب القطع بعمق زائد لأن ذلك سيؤدي إلى إصابة الانتفاخ. قم بإزالة أي دم عن طريق رش محلول HBSS بشكل متكرر حتى يختفي. ويعد ظهور الدم مؤشراً جيداً على أن القطع كان بالعمق الكافي.

بعد ذلك، قم بإجراء قطع مستعرض فوق مستوى الجيب المخروطي، ثم قم بإجراء قطع مستعرض ثانٍ عند المستوى الموجود داخل الجيب الحلقي بالقرب جداً من الجلد ضمن قطعة الجريب المعزولة. ستظهر لك الآن البروزات داخل المحفظة. انظر، ها هي هناك.

أمسك طرف الكبسولة باستخدام الملقط وقم بإزالة الانتفاخ. ستظهر لك الآن الكبسولة الفارغة ومجموعة الانتفاخات المعزولة. تُحفظ الانتفاخات المعزولة في طبق زراعة منفصل يحتوي على HBSS في درجة حرارة الغرفة.

تأكد من عدم وجود أي أنسجة أخرى تلوث النتوءات المجمعة. في هذه المرحلة، يمكن استزراع نباتات النتوءات قبل الاستزراع في نباتات bul. يتم طلاء أطباق استزراع بقطر 35 millimeter بالكولاجين عن طريق وضع قطرات بحجم 50 microliter من الكولاجين و10 microliter من المحلول المعقم.

محلول ملحي بتركيز 6% بجانب بعضهما البعض. اخلط جيداً باستخدام ماصة باستير مثنية مرتين وادفع الخليط نحو حافة طبق الزرع، ثم حضن العينات طوال الليل في بيئة نظيفة مع الحرص على عدم جفافها. ونستخدم لهذا الغرض مجففاً يحتوي على طبق من الماء في القاع.

في اليوم التالي، وهو يوم الزرع. اشطف الأطباق بمحلول ملحي، ثم قم بحضنها مسبقاً في وسط الزرع داخل الحاضنة لمدة ثلاث ساعات تقريباً، باستخدام أطباق زرع مغلفة بالكولاجين ومغسولة. يتكون وسط الزرع من 85% alpha modified MEM، و 10% fetal bovine serum، و 5% day 11 chick embryo extract.

بعد فترة التحضين المسبق، قم بإزالة وسط الزرع من الأطباق وأضف عدة BULs مع أقل كمية ممكنة من الوسط. قم بإزالة وسط الزرع الزائد. حضن العينات لمدة ساعة واحدة في حاضنة خلايا في جو رطب يحتوي على 10%oxygen و 5%CO2.

بعد مرور ساعة واحدة، أضف 1.5 milliliter من الوسط الزراعي ببطء. يجب أن تلتصق نباتات Medium CHE بالطبقة التحتية من كولاجين col؛ استبدل 50% من الوسط الزراعي يومياً. حسناً، لنبدأ الآن.

والآن نلقي نظرة على المزارع الخلوية. فخلال ثلاثة إلى أربعة أيام، ستهاجر خلايا ذات قدرة عالية على الهجرة من كرات الفحص. يرجى ملاحظة شكلها النجمي والغياب السائد للاتصالات بين الخلايا.

خلال الأيام القليلة القادمة، ستهاجر المزيد من الخلايا، وستتكاثر الخلايا المهاجرة بسرعة، بما في ذلك خلايا نادرة ومهمة ذات شكل مسطح، والتي تظهر أحيانًا بعد عدة أيام من ظهور خلايا العرف العصبي البشروي. كما تُلاحظ أحيانًا خلايا جذعية في هذه المزارع؛ وهذه الخلايا ليست خلايا جذعية للعرف العصبي البشروي، بل هي بدلاً من ذلك خلايا جذعية بشروية مفترضة أو خلايا سلفية أقل حركة، لذا يجب التخلص من المزارع التي تتكون من هذه الخلايا.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تحضير مستنبتات قطعة المنتفخ (bulge explan) التي تحتوي على خلايا جذعية عصبية بشرية من البشرة. ونظراً لأن الخلايا العصبية تتميز بقدرة عالية على الهجرة، فإنها ستغادر قطعة المنتفخ في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام. وبعد عملية الزرع، يتم إزالة المنتفخ، لتبقى المجموعة النقية من الخلايا العصبية في طبق المستنبت.

عند إجراء هذه العملية، من المهم تذكر تعقيم الفأر بعناية لتجنب التلوث. كما يجب القطع بعمق في وسادة القدم لتفادي إصابة الجريبات. وفيما يتعلق بالمزارع الخلوية، من المهم التمييز بين المقطر المهاجر، وخلايا العرف العصبي، والخلايا الكيراتينية غير المهاجرة ذات الشكل المرصوف.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.