التمايز في المختبر من خلايا الجنينية الماوس (MES) الجذعية باستخدام أسلوب إسقاط الشنق

تمتلك الخلايا الجذعية قدرة فائقة على التطور إلى العديد من أنواع الخلايا المختلفة في الجسم، حيث تعمل بمثابة نظام إصلاح للجسم. ومن الناحية النظرية، يمكنها الانقسام دون حدود لتعويض الخلايا الأخرى.

عندما تنقسم الخلية الجذعية، تمتلك كل خلية جديدة القدرة إما على البقاء كخلية جذعية أو أن تصبح نوعاً آخر من الخلايا ذات وظيفة أكثر تخصصاً. ويقود هذا المجال العلمي الواعد العلماء إلى استقصاء إمكانية استخدام العلاجات القائمة على الخلايا لعلاج الأمراض في المختبر. ويحدث تمايز الخلايا الجذعية الجنينية عندما يُسمح للخلايا بالتجمع في مستنبت معلق.

في حالة عدم وجود خلايا مغذية من أرومات ليفية جنينية للفئران وعامل تثبيط ليوكيميا، تُسمى هذه التجمعات الخلوية أجساماً جنينية. وتعد طريقة القطرة المعلقة إحدى الإجراءات الفعالة لتمايز الخلايا الجذعية إلى أجسام جنينية في المختبر. مرحباً، أنا شا جوان من قسم طب القلب والأوعية الدموية في جامعة ستانفورد.

سنعرض لكم اليوم إجراءً للتمايز الفردي للخلايا الجذعية الجنينية إلى أجسام جنينية باستخدام طريقة القطرة اليدوية. وعادة ما نستخدم هذه الطريقة لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى خلايا عضلة القلب. يتضمن هذا الإجراء الخطوات التالية: تحضير معلق خلوي أحادي للخلايا الجذعية الجنينية، وإنشاء مستنبتات القطرة اليدوية، ونقل مستنبتات القطرة اليدوية إلى أطباق ذات قدرة ارتباط منخفضة للغاية، وزراعة الأجسام الجنينية في أطباق مغطاة بالجيلاتين.

حسناً، لنبدأ الآن. تتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في تحضير معلق خلوي أحادي للخلايا الجذعية الجنينية. ونظراً لأننا نقوم بزراعة الخلايا الجذعية الجنينية غير المتمايزة عن طريق تنميتها على أرومات ليفية جنينية للفئران، فيجب علينا فصل الخلايا وعزلها عن الأرومات الليفية.

للقيام بذلك، نقوم بفك تجمعات الخلايا باستخدام التريبسين وفقاً للإجراءات القياسية. وبمجرد اكتمال عملية المعاملة بالتريبسين، يتم إضافة وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفئران لمعادلة التريبسين. بعد ذلك، يتم نقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ml.

بعد ذلك، قم بتفكيك مستعمرات الخلايا عن طريق السحب والضخ باستخدام الماصة مقابل قاع الأنبوب حتى تحصل على معلق خلايا ناعم خالٍ من أي تكتلات مرئية. الآن، قم بتدوير الخلايا بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق. بعد تدوير الخلايا، اشفط السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا باستخدام 10 mL من الوسط الغذائي لخلايا ES الفأرية.

انقل معلق الخلايا إلى دورق T 75 مُغطى مسبقاً بـ 0.1% gelatin واحضنه عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة ساعة واحدة. بعد مرور ساعة، تكون الخلايا الليفية قد التصقت بالطبق، بينما تظل الخلايا الجذعية في الوسط. اسحب الوسط باستخدام الماصة لجمع الخلايا الجذعية.

قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق واسحب الوسط. ثم أضف 10 mL أخرى من وسط التمايز، وأعد تعليق الخلايا عن طريق السحب والضخ المتكرر بالماصة حتى يظهر تعليق ناعم من الخلايا. قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer).

نحن الآن مستعدون لاستزراع معلق الخلايا باستخدام طريقة القطرة المعلقة. لبدء استزراع القطرة المعلقة، استخدم وسط التمايز لتخفيف معلق الخلايا الجذعية إلى تركيز 500 خلية لكل 20 µL. بعد ذلك، اقلب غطاء طبق زراعة الأنسجة قياس 150 millimeter.

بعد ذلك، قم بنقل 20 µL من معلق الخلايا باستخدام الماصة إلى السطح الداخلي لغطاء الطبق. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 10 mL من PBS إلى الطبق. اقلب غطاء الطبق بسرعة وضعه برفق فوق الطبق لتكوين القطرات المعلقة.

بمجرد وضع غطاء الطبق في مكانه، انقل الطبق بعناية إلى الحاضنة للزراعة. تُترك الخلايا دون إزعاج لمدة يومين. وبمجرد اكتمال فترة التحضين، سننتقل إلى نقل مزرعة القطرة المعلقة إلى أطباق ذات ارتباط منخفض للغاية.

بعد يومين، اقلب غطاء الطبق بعناية ثم اسحب 180 µL من وسط التمايز الطازج، وضع عدة قطرات منه في طبق 96 بئراً فائق انخفاض الالتصاق. بعد ذلك، التقط القطرات باستخدام ماصة وانقلها واحدة تلو الأخرى إلى طبق الـ 96 بئراً. ضع الأطباق في الحاضنة دون تحريك لمدة ثلاثة أيام.

ستستمر أجسام الأجنة في النمو لتتخذ شكلاً كروياً. وعندما تكتمل عملية الحضن، سنكون مستعدين لزراعة أجسام الأجنة في أطباق، وذلك لمساعدتها على مواصلة التمايز.

نقوم بنقلها إلى طبق مكون من 48 بئراً مغلف بالجيلاتين. وللقيام بذلك، نقوم أولاً بتغليف كل بئر من الطبق بـ 300 µL من الجيلاتين بتركيز 0.1%. وبعد إضافة الجيلاتين، يتم تحضين الطبق طوال الليل عند 37 °C.

في اليوم التالي، قم بشفط الجيلاتين من الطبق المكون من 48 بئراً. ثم أضف 300 µL من وسط التمايز إلى كل بئر. والآن، انقل أجسام الأجنة واحدة تلو الأخرى من الطبق المكون من 96 بئراً إلى الأطباق المكونة من 48 بئراً والمطلية بالجيلاتين.

عادةً ما نقوم بتغيير الوسط في اليوم التالي، ثم كل يومين للحفاظ على الخلايا. نستخدم هذه الطريقة للبحث عن بروتوكولات أفضل لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية. وفيما يخص الخلايا العضلية القلبية، فقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء التمايز في المختبر للخلايا الجذعية الجنينية للفأر باستخدام مزارع القطرة المعلقة.

تعد هذه الطريقة فعالة لأن القاع المستدير للقطرة المعلقة يسمح بتجمع الخلايا الجذعية الجنينية، مما يوفر بيئة جيدة لتكوين الأجسام الجنينية (Embry bodies). وعند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أنه يمكن التحكم في عدد الخلايا الجذعية الجنينية المتجمعة في القطرة المعلقة عن طريق تغيير عدد الخلايا في معلق الخلايا الأولي. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة. مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.