التمايز في المختبر من خلايا الجنينية الماوس (MES) الجذعية باستخدام أسلوب إسقاط الشنق

تتمتع الخلايا الجذعية بإمكانية كبيرة للتطور إلى العديد من أنواع الخلايا المختلفة في الجسم. بمثابة نوع من نظام إصلاح الجسم. يمكنهم نظريا الانقسام بلا حدود لتجديد الخلايا الأخرى.

عندما تنقسم الخلية الجذعية ، فإن كل خلية جديدة لديها القدرة على أن تظل خلية جذعية أو تصبح نوعا آخر من الخلايا ذات وظيفة أكثر تخصصا. يقود هذا المجال الواعد من العلوم العلماء إلى التحقيق في إمكانية العلاجات القائمة على الخلايا لعلاج الأمراض في المختبر. يحدث تمايز الخلايا الجذعية الجنينية عندما يسمح للخلايا بالتجمع في ثقافة معلقة.

في حالة عدم وجود مغذيات جنينية للفأر والخلايا الليفية وعامل مثبط لسرطان الدم ، تسمى هذه المجاميع الخلوية أجسام الجنين. طريقة القطرة المعلقة هي أحد الإجراءات الفعالة لتمايز الخلايا الجذعية إلى أجسام جنينية في المختبر. مرحبا ، أنا شا خوان من اليسار في قسم طب القلب والأوعية الدموية في جامعة ستانفورد.

سنعرض لك اليوم إجراء للتمايز الفردي للخلايا الجذعية الجنينية لإزالة الجسم باستخدام طريقة إسقاط اليد. نستخدم هذه الطريقة عادة لتفريق الخلايا الجذعية الجنينية إلى خلايا عضلة القلب. هذا الإجراء ، بما في ذلك الخطوات التالية ، إعداد معلق خلية واحدة من الخلايا الجذعية الجنينية ، وتوليد مزارع قطرة اليد ، ونقل مزارع الإسقاط اليدوي إلى ألواح التعلق المنخفضة للغاية ، وأجسام الطلاء على ألواح مطلية بالجوت.

حسنا ، دعنا نبدأ. تتمثل الخطوة الأولى في الإجراء في تحضير معلق خلية واحدة من الخلايا الجذعية الجنينية. نظرا لأننا نزرع الخلايا الجذعية الجنينية غير المتمايزة عن طريق زراعتها على الخلايا الليفية الجنينية للفأر ، يجب علينا فصل الخلايا وفصلها عن الخلايا الليفية.

للقيام بذلك ، نحاول التخمين على الخلايا باستخدام الإجراءات القياسية. بمجرد اكتمال المحاولة والعلاج ، أضف وسط الخلايا الجذعية الجنينية للفأر لتحييد التربسين. بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي الشكل 15 مل.

ثم قم بتفكيك مستعمرات الخلايا عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل على قاع الأنبوب حتى تحصل على تعليق دقيق للخلايا دون أي كتل مرئية. الآن قم بتدوير الخلايا بألف دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق. بعد الدوران ، تستنشق الخلايا من الغطاء الخارفي وتعيد تعليق الخلايا ب 10 مل من خلية ES للفأر. متوسط.

انقل تعليق الخلية إلى قارورة T 75 مشفرة مسبقا بجيلاتين 0.1٪ واحتضانها عند 37 درجة مع 5٪ CO2 لمدة ساعة واحدة. بعد ساعة واحدة ، تلتصق الخلايا الليفية بالصفيحة ، لكن الخلايا الجذعية تبقى في الوسط. ماصة الوسط لجمع الخلايا الجذعية.

قم بتدوير الخلايا بألف دورة في الدقيقة لمدة خمس دقائق واستنشق من الوسط. ثم أضف 10 مل أخرى من وسط التمايز ، وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات المتكرر حتى يبدو أن هناك تعليقا دقيقا للخلايا. عد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

نحن الآن جاهزون لزراعة تعليق الخلية باستخدام طريقة الإسقاط المعلق. لبدء ثقافة القطرة المعلقة ، استخدم وسيط التمايز لتخفيف تعليق الخلايا الجذعية إلى تركيز 500 خلية لكل 20 ميكرولترا. بعد ذلك ، اقلب غطاء لوحة زراعة الأنسجة مقاس 150 ملم.

ثم قم بوضع 20 ميكرولترا من تعليق الخلية على السطح الداخلي لغطاء اللوحة. باستخدام ماصة متعددة القنوات ، أضف 10 مل من PBS إلى اللوحة. اقلب غطاء اللوحة بسرعة وضعه برفق على اللوحة لتشكيل القطرات المعلقة.

بمجرد وضع غطاء اللوحة في مكانه ، انقل اللوحة بعناية إلى ثقافة الحاضنة. الزنازين دون إزعاج لمدة يومين. بمجرد اكتمال الحضانة ، سننتقل إلى نقل ثقافة القطرة المعلقة إلى ألواح التثبيت المنخفضة للغاية.

بعد يومين ، اقلب غطاء اللوحة بعناية بعد ذلك ، قم بشفط 180 ميكرولتر من وسط التمايز الطازج ، وضع عدة قطرات في لوحة تثبيت منخفضة للغاية 96 جيدا. ثم التقط القطرات بماصة وانقلها واحدة تلو الأخرى إلى لوحة البئر 96. ضع الأطباق في الحاضنة دون إزعاج لمدة ثلاثة أيام.

ستستمر أجسام الجنين في النمو إلى شكل كرة. عند اكتمال الحضانة ، سنكون مستعدين لصفيحة أجسام الجنين. من أجل مساعدة أجسام الجنين على الاستمرار في التمايز.

ننقلها إلى صفيحة مطلية بالجيلاتين 48 جيدا. للقيام بذلك ، نقوم أولا بتغطية كل بئر من اللوحة ب 300 ميكرولتر من الجيلاتين 0.1٪. بعد إضافة الجيلاتين ، احتضن الطبق طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

في اليوم التالي ، استنشق الجيلاتين من لوحة 48 بئر. ثم أضف 300 ميكرولتر من وسط التمايز لكل منهما. حسنا ، الآن ، تنقل أجسام الأجنة واحدة تلو الأخرى من البئر 96 إلى 48 لوحة مطلية بالجيلاتين.

عادة ما نقوم بتغيير الوسيط في اليوم التالي ثم كل يومين للحفاظ على الخلايا. نستخدم هذه الطريقة للبحث عن بروتوكولات أفضل لتمييز الخلايا الجذعية الجنينية. في خلايا عضلة القلب ، أوضحنا لك للتو كيفية إجراء التمايز في المختبر للخلايا الجذعية الجنينية للفأر باستخدام مزارع القطرات المعلقة.

هذه الطريقة فعالة لأن الجزء السفلي المستدير من القطرة المعلقة يسمح بتجميع الخلايا الجذعية الجنينية ، وبالتالي توفير بيئة جيدة لتكوين أجسام Embry. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أنه يمكن التحكم في عدد الخلايا الجذعية الجنينية المجمعة في قطرة معلقة عن طريق تغيير عدد الخلايا في معلق الخلية الأولي. هذا هو.

شكرا للمشاهدة. حظا سعيدا في تجربتك.