Name: التمايز في المختبر من خلايا الجنينية الماوس (MES) الجذعية باستخدام أسلوب إسقاط الشنق (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: تعلم التمايز في المختبر لخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام أسلوب إسقاط الشنق. هذه التقنية تُمكّن الباحثين من دراسة تكوين الأجسام الجنينية وتطبيقات الطب التجددي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهلم T75 القارورة باستخدام محلول 0.1 ٪ الجيلاتين واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 زراعة الأنسجة حاضنة قبل يوم واحد بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أخرج من احتضان خلايا MES ، نضح المتوسط ​​، شطف خلية ثقافة وفاق مع برنامج تلفزيوني ، إضافة 0.05 ٪ إلى حل التربسين معطف أسفل الطبق (2 صفيحة ml/100mm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 1 دقيقة ، حتى الخلايا هي النزع قبالة لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متمزج بلطف (الماصة صعودا وهبوطا) الخلايا trypsinized أربع إلى ست مرات لتفريق الخلايا وفاق مع ماصة باستير توصيله. نقل الخلايا ES فرقت في أنبوب 15 مل تحتوي على أجهزة الطرد المركزي المخروطية prewarmed (37 درجة مئوية) MES المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي. نضح لطاف ، أضف 10 مل من وزارة التربية والعلم المتوسطة ماصة صعودا وهبوطا لتشكيل تعليق خلية واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل تعليق خلية في قارورة T75 قبل المغلفة مع 0.1 ٪ في الجيلاتين واحتضان 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 لمدة ساعة واحدة * بعد ساعة واحدة ، قد أولت الليفية إلى لوحة الخلايا الجذعية ولكن تبقى في المتوسط. ماصة يصل المتوسط ​​لجمع الخلايا الجذعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور الخلايا في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ، ونضح قبالة المتوسطة زارة التربية والعلم. ثم يضاف 10 مل أخرى من المتوسطة وزارة التربية والعلم تمايز الخلايا عن طريق resuspend pipetting المتكررة حتى يبدو أن هناك تعليق غرامة من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الخلايا التي تحتوي على التفريق المتوسطة عدادة الكريات تستخدم لتخفيف تعليق الخلايا الجذعية إلى التركيز بين 400 إلى 500 خلية لكل 20ul (20ul/drop) في حوض العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع الغطاء ، عكس بعناية ووضعه على قمة من صحن يحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني. باستخدام ماصة الأقنية ، وجعل الصفوف من قطرات 20ul على السطح حتى تحول الداخلي للغطاء من النسيج صحن الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان بعناية الطبق في الحاضنة لمدة 2 ايام. بعد يومين ، بدوره بعناية على مدى غطاء لوحة ، ونضح 180 UL متوسطة التمايز الطازجة ووضع عدة قطرات في البئر لوحة ultralow مرفق 96 - جيدا. ثم تراجع لاقط مع قطرات ماصة ونقلها ، واحدة تلو الأخرى ، لوحة 96 - جيدا. وضع لوحات في الحاضنة لمدة 3 أيام دون عائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معطف كل بئر لزراعة الأنسجة 48 لوحة جيدا مع 300ul من 0.1 ٪ الجيلاتين. بعد إضافة الجيلاتين ، واحتضان لوحة ليلا 37 درجة مئوية قبل يوم واحد قبل نقل EBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي ، نضح في الجيلاتين من 48 لوحة جيدا. ثم يضاف 300 UL متوسطة التمايز إلى كل بئر. نقل الصفائح الحديدية من 96 إلى جانب لوحات 48 الجيلاتين المغلفة جيدا واحدة تلو الأخرى. تغيير المتوسطة في اليوم التالي ثم تغيير المتوسط ​​كل يوم للحفاظ على الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن تقلصات cardiaomyocyte عفوية يكون واضحا في غضون 7 أيام. </li></ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

مساوئ أسلوب قطرة شنقا هي كما يلي : يقتصر حجم السائل لتنخفض إلى أقل من 50ul بسبب الحفاظ على قطرات المعلقة على غطاء من التوتر السطحي ، وانه من المستحيل تغيير وسيلة لتعليق قطرات. الملاحظة تشكيل EBS في قطرات مباشرة مع المجهري هو أيضا من الصعب جدا خلال زراعة. مزيد المزيد ، وطريقة قطرة شنقا يتكون من خطوتين ، وبالتالي ، قد يكون خطوة من سلسلة من الأسلوب قطرة شنقا يكون مزعجا.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>كاشف</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>مصل جنين البقر (FBS)</td><td>كاشف</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>كاشف</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>أحماض أمينية غير أساسية</td><td>كاشف</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>بنسلين / ستربتومايسين</td><td>كاشف</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>بيروفات الصوديوم</td><td>كاشف</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>كاشف</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>عامل تثبيط اللوكيميا (LIF)</td><td>كاشف</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>لوحة ذات 96 بئراً ذات ارتباط منخفض للغاية</td><td>أداة</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

التمايز في المختبر من خلايا الجنينية الماوس (mes) الجذعية باستخدام أسلوب إسقاط الشنق

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

الخلايا الجذعية لديها القدرة على تطوير ملحوظ في العديد من أنواع مختلفة من الخلايا. عندما يقسم الخلايا الجذعية ، فإن كل خلية جديدة لديها القدرة على البقاء إما أو تصبح الخلايا الجذعية نوع آخر من الخلايا ذات وظيفة أكثر تخصصا ، وهذا العلم هو واعد كبار العلماء لدراسة إمكانية خلية مقرها العلاجات لعلاج المرض. عندما الثقافة في الوقف بدون عوامل antidifferentiation ، والخلايا الجذعية الجنينية تفرق بشكل عفوي وشكل ثلاثي الأبعاد مجاميع متعددة الخلايا. وتسمى هذه المجاميع الخلية الهيئات مضغي الشكل (EB). اعدام ثقافة الإفلات من تشكيل EB المستخدمة على نطاق واسع طريقة الاستقراء. الجزء السفلي من قطرة شنقا تقريب يسمح تجميع الخلايا ES الخلايا التي يمكن أن توفر بيئة جيدة زارة التربية والعلم لتشكيل EBS. يمكن السيطرة على عدد من الخلايا ES aggregatied في انخفاض شنقا متفاوتة عدد من الخلايا في خلية تعليق أولي على أن تكون معلقة على قطرة من غطاء طبق بيتري. باستخدام هذا الأسلوب يمكن أن نشكل بتكاثر EBS متجانسة من عدد محدد مسبقا من الخلايا ES.

هذا الفيديو يوضح كيفية السلوك في المختبر من تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للهيئات مضغي الشكل باستخدام طريقة قطرة شنقا.

التمايز في المختبر من خلايا الجنينية الماوس (MES) الجذعية باستخدام أسلوب إسقاط الشنق

تمتلك الخلايا الجذعية قدرة فائقة على التطور إلى أنواع مختلفة من الخلايا. وعندما تنقسم الخلية الجذعية، تملك كل خلية جديدة القدرة إما على...

تمتلك الخلايا الجذعية قدرة فائقة على التطور إلى العديد من أنواع الخلايا المختلفة في الجسم، حيث تعمل بمثابة نظام إصلاح للجسم. ومن الناحية النظرية، يمكنها الانقسام دون حدود لتعويض الخلايا الأخرى.عندما تنقسم الخلية الجذعية، تمتلك كل خلية جديدة القدرة إما على البقاء كخلية جذعية أو أن تصبح نوعاً آخر من الخلايا ذات وظيفة أكثر تخصصاً. ويقود هذا المجال العلمي الواعد العلماء إلى استقصاء إمكانية استخدام العلاجات القائمة على الخلايا لعلاج الأمراض في المختبر. ويحدث تمايز الخلايا الجذعية الجنينية عندما يُسمح للخلايا بالتجمع في مستنبت معلق.في حالة عدم وجود خلايا مغذية من أرومات ليفية جنينية للفئران وعامل تثبيط ليوكيميا، تُسمى هذه التجمعات الخلوية أجساماً جنينية. وتعد طريقة القطرة المعلقة إحدى الإجراءات الفعالة لتمايز الخلايا الجذعية إلى أجسام جنينية في المختبر. مرحباً، أنا شا جوان من قسم طب القلب والأوعية الدموية في جامعة ستانفورد.سنعرض لكم اليوم إجراءً للتمايز الفردي للخلايا الجذعية الجنينية إلى أجسام جنينية باستخدام طريقة القطرة اليدوية. وعادة ما نستخدم هذه الطريقة لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية إلى خلايا عضلة القلب. يتضمن هذا الإجراء الخطوات التالية: تحضير معلق خلوي أحادي للخلايا الجذعية الجنينية، وإنشاء مستنبتات القطرة اليدوية، ونقل مستنبتات القطرة اليدوية إلى أطباق ذات قدرة ارتباط منخفضة للغاية، وزراعة الأجسام الجنينية في أطباق مغطاة بالجيلاتين.حسناً، لنبدأ الآن. تتمثل الخطوة الأولى من الإجراء في تحضير معلق خلوي أحادي للخلايا الجذعية الجنينية. ونظراً لأننا نقوم بزراعة الخلايا الجذعية الجنينية غير المتمايزة عن طريق تنميتها على أرومات ليفية جنينية للفئران، فيجب علينا فصل الخلايا وعزلها عن الأرومات الليفية.للقيام بذلك، نقوم بفك تجمعات الخلايا باستخدام التريبسين وفقاً للإجراءات القياسية. وبمجرد اكتمال عملية المعاملة بالتريبسين، يتم إضافة وسط زراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفئران لمعادلة التريبسين. بعد ذلك، يتم نقل معلق الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ml.بعد ذلك، قم بتفكيك مستعمرات الخلايا عن طريق السحب والضخ باستخدام الماصة مقابل قاع الأنبوب حتى تحصل على معلق خلايا ناعم خالٍ من أي تكتلات مرئية. الآن، قم بتدوير الخلايا بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق. بعد تدوير الخلايا، اشفط السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا باستخدام 10 mL من الوسط الغذائي لخلايا ES الفأرية.انقل معلق الخلايا إلى دورق T 75 مُغطى مسبقاً بـ 0.1% gelatin واحضنه عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لمدة ساعة واحدة. بعد مرور ساعة، تكون الخلايا الليفية قد التصقت بالطبق، بينما تظل الخلايا الجذعية في الوسط. اسحب الوسط باستخدام الماصة لجمع الخلايا الجذعية.قم بطرد الخلايا مركزياً بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق واسحب الوسط. ثم أضف 10 mL أخرى من وسط التمايز، وأعد تعليق الخلايا عن طريق السحب والضخ المتكرر بالماصة حتى يظهر تعليق ناعم من الخلايا. قم بعدّ الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer).نحن الآن مستعدون لاستزراع معلق الخلايا باستخدام طريقة القطرة المعلقة. لبدء استزراع القطرة المعلقة، استخدم وسط التمايز لتخفيف معلق الخلايا الجذعية إلى تركيز 500 خلية لكل 20 µL. بعد ذلك، اقلب غطاء طبق زراعة الأنسجة قياس 150 millimeter.بعد ذلك، قم بنقل 20 µL من معلق الخلايا باستخدام الماصة إلى السطح الداخلي لغطاء الطبق. وباستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 10 mL من PBS إلى الطبق. اقلب غطاء الطبق بسرعة وضعه برفق فوق الطبق لتكوين القطرات المعلقة.بمجرد وضع غطاء الطبق في مكانه، انقل الطبق بعناية إلى الحاضنة للزراعة. تُترك الخلايا دون إزعاج لمدة يومين. وبمجرد اكتمال فترة التحضين، سننتقل إلى نقل مزرعة القطرة المعلقة إلى أطباق ذات ارتباط منخفض للغاية.بعد يومين، اقلب غطاء الطبق بعناية ثم اسحب 180 µL من وسط التمايز الطازج، وضع عدة قطرات منه في طبق 96 بئراً فائق انخفاض الالتصاق. بعد ذلك، التقط القطرات باستخدام ماصة وانقلها واحدة تلو الأخرى إلى طبق الـ 96 بئراً. ضع الأطباق في الحاضنة دون تحريك لمدة ثلاثة أيام.ستستمر أجسام الأجنة في النمو لتتخذ شكلاً كروياً. وعندما تكتمل عملية الحضن، سنكون مستعدين لزراعة أجسام الأجنة في أطباق، وذلك لمساعدتها على مواصلة التمايز.نقوم بنقلها إلى طبق مكون من 48 بئراً مغلف بالجيلاتين. وللقيام بذلك، نقوم أولاً بتغليف كل بئر من الطبق بـ 300 µL من الجيلاتين بتركيز 0.1%. وبعد إضافة الجيلاتين، يتم تحضين الطبق طوال الليل عند 37 °C.في اليوم التالي، قم بشفط الجيلاتين من الطبق المكون من 48 بئراً. ثم أضف 300 µL من وسط التمايز إلى كل بئر. والآن، انقل أجسام الأجنة واحدة تلو الأخرى من الطبق المكون من 96 بئراً إلى الأطباق المكونة من 48 بئراً والمطلية بالجيلاتين.عادةً ما نقوم بتغيير الوسط في اليوم التالي، ثم كل يومين للحفاظ على الخلايا. نستخدم هذه الطريقة للبحث عن بروتوكولات أفضل لتمايز الخلايا الجذعية الجنينية. وفيما يخص الخلايا العضلية القلبية، فقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء التمايز في المختبر للخلايا الجذعية الجنينية للفأر باستخدام مزارع القطرة المعلقة.تعد هذه الطريقة فعالة لأن القاع المستدير للقطرة المعلقة يسمح بتجمع الخلايا الجذعية الجنينية، مما يوفر بيئة جيدة لتكوين الأجسام الجنينية (Embry bodies). وعند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أنه يمكن التحكم في عدد الخلايا الجذعية الجنينية المتجمعة في القطرة المعلقة عن طريق تغيير عدد الخلايا في معلق الخلايا الأولي. هذا كل شيء.شكرًا للمشاهدة. مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.

in-vitro-differentiation-mouse-embryonic-stem-mes-cells-using-hanging

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

تفاصيل هذا البروتوكول اشتقاق زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم من الخلايا الجذعية الجنينية (ESC) ، والحقن في وقت لاحق في الفئران المتلقي المشع القاتلة. باختصار ، كانت متباينة ESC كهيئات مضغي الشكل ، والذي يصاب بعد ذلك مع HoxB4 فيروسات وشارك في تربيتها مع OP9 الخلايا اللحمية والسيتوكينات المكونة للدم.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

نعرض طريقة بسيطة وسريعة لتحميل أرقام محددة مسبقا من الخلايا في الآبار وصيانتها microfabricated للتنمية الجسم مضغي الشكل.

Shrinky - دينك قطرة الشنق : وسيلة بسيطة إلى نموذج الثقافة والأجرام مضغي الشكل

نحن تصف استخدام خلية مقايسة الماوس ES يستند إلى تحديد النوافذ وقت حرج بالنسبة لcatenin - β Wnt / BMP وتفعيل إشارة قلبية خلال الاستقراء. الأسلوب يوفر منصة موحدة يحدد مقدار الكفاءة موثوق قلبية ، وأنه قابل للتطبيق لدراسة الأنساب خلية أخرى.

تعديل الجذعية الجنينية الماوس الفحص خلية مقرها لقياس كفاءة قلبية التعريفي

قمنا بتطوير بروتوكول جديد لتحسين كفاءة المختبر في تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية. حصلت على خلايا ES متباينة الخلايا العصبية الحركية يتميز كما يتضح من التعبير عن علامات الخلايا العصبية الحركية والخلايا العصبية باستخدام تقنيات المناعى.

كفاءة تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في الخلايا العصبية الحركية

يوضح الفيديو تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mESCs) إلى الأجسام الجنينية (EBs) بطريقة القطرة المعلقة. عند تعليق mESCs في قطرات معلقة واحتضانها ، تتجمع الخلايا لتشكيل EBs ، والتي يتم تمييزها بشكل أكبر إلى خلايا سلفية عصبية (NPCs) باستخدام وسيط تمايز مكمل بحمض الريتينويك (RA).

توليد الأسلاف العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر بطريقة القطرة المعلقة

يوضح هذا الفيديو طريقة لتوليد الخلايا السلفية العصبية في المختبر (NPCs) من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر (mESCs). يتم استزراع mESCs في تعليق لتشكيل أجسام جنينية (EBs) ، والتي يتم توجيهها بعد ذلك للتمايز إلى NPCs عن طريق معالجة حمض الريتينويك في ثقافة ملتصقة.

تقنية لتوليد الخلايا السلفية العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية للفأر

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة توليد الأسلاف العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية باستخدام طريقة أحادية الطبقة الخالية من المصل. يمكن استخدام هذه الأسلاف لاشتقاق أنواع الخلايا العصبية الناضجة أو لدراسة عملية المواصفات العصبية وهي قابلة لتحجيم تنسيق متعدد الآبار للفحص المركب.

التمايز العصبي للماوس الخلايا الجذعية الجنينية في المصل خالية أحادي الطبقة الثقافة

ويصف هذا البروتوكول وسيلة لتوليد المتكفل إينتيرنيورون القشرية والسلائف الانقسامية بعد إينتيرنيورون من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس استخدام أسلوب الهيئة لأحادي الطبقة امبريويد معدلة. سلائف موروث يمكن أن تستخدم في المختبر أو فلوريسسينتلي فرز وزرعها في اللحاء الوليد الجديد لدراسة تحديد مصير، أو المستخدمة في التطبيقات العلاجية.

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في السلائف إينتيرنيورون القشرية

هنا، أنشأنا طريقة منخفضة التكلفة وسهلة التشغيل التي توجه التمايز السريع والفعال من الخلايا الجذعية الجنينية إلى الخلايا العصبية. هذه الطريقة مناسبة لتعميم بين المختبرات ويمكن أن تكون أداة مفيدة للبحوث العصبية.

التمايز العصبي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في المختبر

نحن نصف الإجراء للتمايز في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في الخلايا العصبية باستخدام طريقة إسقاط شنقا. وعلاوة على ذلك، نقوم بإجراء تحليل phenotypic شامل من خلال RT-qPCR، immunofluorescence، RNA-seq، وتدفق قياس الخلايا.

التمايز وتوصيف السلف العصبية والخلايا العصبية من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس

تعلم التمايز في المختبر لخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام أسلوب إسقاط الشنق. هذه التقنية تُمكّن الباحثين من دراسة تكوين الأجسام الجنينية وتطبيقات الطب التجددي.

التمايز في المختبر من خلايا الجنينية الماوس (MES) الجذعية باستخدام أسلوب إسقاط الشنق

استكشف المزيد من الفيديوهات