توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

أناقة البحر هي كائن حي نموذجي مفيد بشكل لا يصدق نظرا لمعرفتنا بسلالات الخلايا بالإضافة إلى ثروة المعلومات الناتجة عن تسلسل وتحليل الجينوم بالكامل. في هذا الفيديو ، نوضح عملية الحقن الدقيق للبلازميدات في أناقة البحر واختيار النسل المعدل وراثيا باستخدام الفحص المجهري الفلوري كحيوان شفاف ومتعدد الخلايا ، تعتبر أناقة البحر مثالية لتصور الجينات المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات ذات العلامات الفلورية في الجسم الحي. مرحبا ، اسمي لورا بيركوفيتز وأنا باحث مشارك في مختبر كالدويل في قسم العلوم البيولوجية هنا في جامعة ألاباما.

وأنا آدم نايت ، أيضا من مختبر كالويل في جامعة ألاباما. سأوضح لك اليوم كيفية التحضير لحقن البلازمين المجهري وتنفيذه لتوليد أناقة البحر المعدلة وراثيا ، وسأوضح لك كيفية اختيار خطوط أناقة الختم المعدلة وراثيا والحفاظ عليها. لذلك دعونا نبدأ.

قبل أن نبدأ الحقن المجهري ، لدينا بعض خطوات التحضير ، والتي سأريكم الآن. أولا ، قم بإعداد الحمض النووي البلازميد المراد حقنه ، ويلزم وجود بلازميدين ، أحدهما يشفر التعبير الخاص بالأنسجة للجين الذي يثير اهتمامنا ، والثاني يوفر علامة تحويل قابلة للتحديد. امزج البلازميدات معا بنسبة واحد إلى واحد تبلغ 50 نانوغرام لكل ميكرولتر.

بعد ذلك ، قم بإعداد وسادات المثقاب ، والتي سيتم استخدامها لشل حركة الديدان للحقن. لجعل وسادات المثقاب ، ضع أولا عدة أكواب غطاء مقاس 22 × 50 ملم على سطح الطاولة. باستخدام ماصة المراعي ، ضع قطرة من 2٪ agros المذابة على غطاء زجاج واحد ، ثم ضع على الفور زجاجا ثانيا فوق القطرة بزاوية 90 درجة إلى الأول.

دع الهواء يتجمد لبضع ثوان ثم قم بإزالة زجاج الغطاء العلوي. يجب أن يتراوح قطر القرص المسطح للهواء بين 15 و 20 ملم. مثل الأليفة ، اترك الوسادة تجف تماما في الهواء لعدة ساعات أو طوال الليل.

بمجرد أن تجف ، قم بتخزين الفوط في صندوق زجاجي مغطى في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإعداد لوادر الإبرة لمحلول الحمض النووي. للقيام بذلك ، خذ مائة أنبوب شعري ميكرولتر وقم بتسخينه في منتصف لهب مكشوف واسحبه بسرعة إلى ضعف طوله تقريبا.

بمجرد أن يبرد الأنبوب الشعري ، افصل النصفين عن بعضهما البعض. قم بتخزين 10 إلى 20 لودر إبرة للحقن. يمكنك تخزينها في وضع مستقيم في أنبوب طرد مركزي صغير.

براك ، كن حذرا. نقاط اللودر بالإبرة حادة جدا. الآن اصنع إبر الحقن الدقيقة.

هذه الإبر مصنوعة من أنبوب شعري خاص يحتوي على خيوط زجاجية داخلية. يعمل هذا الفتيل كفتيل لمحلول الحمض النووي. لصنع الإبر ، نستخدم Niki PP eight 30 Polar مع إعداد حرارة 24.8 ، يتم سحب عدة إبر في وقت واحد للتخزين.

يمكن تركيب إبر متعددة على شريط من طين النمذجة. سيتم استخدام شظايا صغيرة من زجاج الغطاء لكسر طرف الإبرة المسحوبة. يتم تحضير هذه القطع عن طريق لف غطاء زجاجي مقاس 18 × 18 ملم في منديل كيم والضغط برفق حتى ينقسم إلى عدة قطع.

استخدم شظايا يبلغ حجمها حوالي ثلاثة × أربعة ملليمترات. بالإضافة إلى تحضير الحمض النووي والإبر ، قم بإعداد حوالي 50 إلى 100 على مراتب بشكل صحيح. اثنان من الديدان من النوع البري لكل بنية متجه تعبير ليتم حقنهما.

نحن الآن على استعداد لإعداد مجهر الحقن المجهري. لبدء إعداد المجهر ، افتح الصمام الرئيسي في خزان الهيليوم المتصل بذراع إبرة الحقن المجهري وحامله. أغلق المنظم للسماح للغاز بالدخول إلى الخط.

رفع الضغط إلى 35 رطل لكل بوصة مربعة ، يمكن إطلاق الغاز باستخدام دواسة القدم. بعد ذلك ، أدخل محمل إبرة في أنبوب ماصة الفم القياسي وقم بإسقاط كمية صغيرة من خليط البلازميد حوالي ميكرولتر واحد. الآن أدخل اللودر برفق على طول الطريق من خلال إبرة الحقن المجهري حتى تشعر بالمقاومة.

طرد محلول الحمض النووي عن طريق النفخ برفق ثم إزالة اللودر. بمجرد تحميل الحمض النووي ، أدخل الإبرة في ذراع الحقن المجهري ، مع الحرص على وضعها داخل الحشية المطاطية الداخلية الصغيرة ثم تثبيتها على ذراع المعالج. بعد ذلك ، ضع قطعة من زجاج الغطاء لكسر الإبرة على حافة واحدة من وسادة المثقاب.

قم بتغطية الشظية وكذلك السطح الكامل لوسادة المثقاب بزيت الكربون المقدس. ثم ضع وسادة المثقاب على مسرح المجهر المقلوب. بعد وضع وسادة المثقاب في مكانها ، ضع الإبرة في وسط حقل المشاهدة باستخدام هدف الفوركس وإضاءة المجال الساطع ، ولكن لا تقم بخفضها بعد في الزيت.

بعد ذلك ، ضع الحافة الداخلية لقطعة زجاج الغطاء في المنتصف ، ثم ركز عليها. اخفض الإبرة في الزيت ، واجعلها في نفس المستوى البؤري مثل شظية زجاج الغطاء. ارفع التكبير عن طريق التبديل إلى الهدف 40 × ، ثم أعد التركيز على حافة الشظية وأعد وضع طرف الإبرة إذا لزم الأمر.

الآن كسر افتح طرف إبرة الحقن. ادفع الإبرة برفق على حافة شظية زجاج الغطاء ، مع تطبيق نبضة قصيرة من الغاز عبر دواسة القدم. سيتم كسر الإبرة بشكل كاف.

عندما تتسرب قطرات صغيرة من السائل من نهاية الإبرة ، فإن تدفق السائل الزائد بسبب الحجم الكبير جدا ، فإن الفتحة غير مرغوب فيها لأنها ستقتل. بمجرد أن تصبح الإبرة جاهزة ، نبدأ الحقن المجهري. بعد ذلك ، قم بإزالة وسادة المثقاب من المسرح عن طريق رفع الإبرة لأعلى.

لكن لا تقم بتغيير موضع المحور X أو Y. حرك المسرح للخارج من تحت الإبرة. قم بإزالة وسادة المثقاب وضعها على مجهر تشريح.

انقل كلمة إلى الوسادة الموجودة أسفل سطح الزيت. إذا كانت الدودة تتلوى برفق حتى تلامس وسادة المثقاب ، فيجب أن تلتصق الدودة الرطبة بالزراعة الجافة. ضع وسادة المثقاب بسرعة مرة أخرى على المسرح ، مع توسيط الدودة في مجال الرؤية.

ثم اخفض الإبرة إلى نفس مستوى التركيز مثل الدودة. قم بتبديل المرشحات الموجودة على النطاق المقلوب إلى إضاءة هوفمان. يسمح مرشح التباين هذا بإظهار التفاصيل المورفولوجية للدودة.

باستخدام الهدف 40 × ، ركز على المركز الحسي المحبب للدودة التناسلية أسفل نمط قرص العسل للنوى الجرثومة. اختر أي غدد تناسلية موضوعة على جانب الدودة المواجهة للإبرة. غرامة. اضبط موضع الإبرة حتى يصبح الطرف في بؤرة التركيز أيضا.

أدخل الإبرة برفق في وسط الغدد التناسلية وقم بتطبيق نبضة قصيرة من ضغط الغاز لطرد قطرة أو قطرتين من الحمض النووي في ذراع الغدد التناسلية. يجب أن تلاحظ موجة من السائل تنتشر عبر الحفرة البعيدة مع الكثير من الممارسة والمهارة. يمكنك الوصول إلى مركز الدافع في كل مرة.

ضع في اعتبارك أنه من المهم العمل بسرعة أثناء حقن دودة. كما يمكن أن يجف بسهولة. يجب أن تستغرق العملية برمتها أقل من دقيقة إلى دقيقتين.

بمجرد اكتمال الحقن ، قم بإزالة وسادة المثقاب من المسرح وضعها على منظار تشريح. ضع ميكرولتر واحد من M تسعة مخزن مؤقت مباشرة على الدودة المحقونة. قد يستلزم ذلك غمر طرف الماصة تحت سطح زيت الهالة الكربوهيدراتية.

يجب أن يعيد المخزن المؤقت ترطيب الدودة ثم يطفو عن سطح وسادة الهواء ، وينقل الدودة إلى صفيحة عادية باستخدام معول دودة. الآن سأقوم بتسليم الديدان المحقونة إلى آدم وسيوضح لنا اختيار وصيانة الخطوط المعدلة وراثيا. يتم نقل الديدان المحقونة إلى صفائح فردية طازجة بذرة 60 ملم ويسمح لها بالتكاثر.

تمثل هذه الديدان الجيل P صفر. عادة ما يتم تحضين المحقونة عند 20 درجة مئوية لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى يظهر النسل. بمجرد ظهور النسل ، نكون مستعدين لبدء فحص الديدان المعدلة وراثيا.

لوحظ النسل F1 للحصول على دليل على العلامة المعدلة وراثيا. في هذه الحالة ، تكون العلامة القابلة للتحديد هي الفلورسنت ، حتى نتمكن من الفرز باستخدام مجهر استريو فلورسنت. يتم استنساخ كل حامل فلورسنت F1 بشكل منفصل على لوحة جديدة.

قد ينتج الصفر P المحقون من واحد إلى خمسة ذرية فلورية فقط من بين كل F1. اسمح للخنثى F1 بالتكاثر عند 20 درجة لمدة يومين إلى ثلاثة أيام حتى يظهر النسل. بمجرد أن يصبح الجيل F الثاني جاهزا ، يتم ملاحظتها للحيوانات المعدلة وراثيا أيضا. F يعتبر حيوانان ورثوا وعبروا عن علامة معدلة وراثيا خطا مستقرا.

يجب الحفاظ على كل خط مستقر مستقل كخط منفصل من الديدان ينشر كل خط عن طريق نقل العديد من المعدلة وراثيا إلى صفيحة جديدة في كل جيل. يجب أن يتم ذلك باستخدام مجهر ستيريو فلورسنت. إذا كانت العلامة القابلة للتحديد فلورية للتحكم في التباين في رقم نسخة الجينات ، فقم بإنشاء ما لا يقل عن ثلاثة خطوط مستقرة مستقلة لكل بناء يتم حقنه.

لقد أوضحنا لك للتو كيفية الحقن الدقيق للتعبير ، وتركيبات المتجهات ، ورؤية elgan وتحديد الخطوط المستقرة. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.