بروتوكولات لMicroapplicator بمساعدة العدوى من اليرقات Lepidopteran مع الفيروسة العصوية

بينما يتم استخدام فيروس الباكالا الخاص بالمفصليات كأداة بحث قياسية لأنظمة التعبير عن البروتين حقيقيات النواة ، يتم تطويره أيضا كعامل مبيد حشري آمن بيئيا ، والذي يمكن أن يقتل حشرات العاشبة مثل حرشفيات الأجنحة في الطبيعة. تصاب يرقات حرشفيات الأجنحة بفيروسات الباكالا عند تناول أوراق الشجر المصابة. تبتلع اليرقات أو اليرقة فيروس الباكالا في شكل يعرف باسم متعدد السطوح ، وهو عبارة عن مركب من جزيئات الفيروس المعبأة في بنية بروتين بلورية كبيرة تحمي الفيروس من الجفاف.

بمجرد إصابة اليرقة ، ينشر الفيروس النطح العدوى داخل الحشرة. يختطف الفيروس آلية تخليق الحمض النووي والبروتين للمضيف لإنتاج المزيد من الفيروسات وتعدد الوجوح. في النهاية ، تصاب اليرقات تماما بالفيروس لدرجة أنها تذوب في نضح فوضوي من متعدد الوجوه الذي يتساقط على أسطح النبات التي تأكلها الحشرة ، ثم تبدأ الدورة من جديد من أجل تحديد فعالية المبيدات الحشرية لباكا معينة.

يمكن الجمع بين تقنيات قضيب سلالة أفير الدقيقة والمقايسات الحيوية. يمكن أن تصاب يرقات الدورين عن طريق حقن فيروس مقطر مباشرة في HemosIL أو تجويف الجسم ويمكن تقييم معدلات الوفيات. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تصاب اليرقات ب polyhedra باستخدام الحقن بمساعدة قضيب دقيق عن طريق الفم ويمكن فحص توقيت إصابة الأمعاء والأنسجة الأخرى.

مرحبا ، أنا ويندي سباركس في مختبر Brian e boning في قسم علم الحشرات بجامعة ولاية أيوا وأنا أيضا من العظام المفاجئة. سنعرض لك اليوم إجراءين لإصابة قناة المختبر DI بفيروس التراكم. كلتا الطريقتين تستخدم قضيب صغير.

أولا ، سأوضح لك استخدام قضيب دقيق لتوصيل فيروس الجسم إلى الهيني من خلال البرول. ثم عند العرض ، يمكنك استخدام قضيب الصغر لتوصيل رأس بولي إلى منتصف الواقي من خلال الماوس. لذلك دعونا نبدأ.

عند تطويرها لأغراض المبيدات الحشرية ، تحتوي فيروسات البالو عادة على جين متعدد السطوح لتسهيل العدوى الفموية ليرقات الآفات. ومع ذلك ، في بعض الأحيان ، هناك أسباب لاختبار فيروس الباكالا السلبي متعدد السطوح بحثا عن تأثيرات مبيدات حشرية محتملة أو لتجاوز أمعاء الحشرة. في هذه الحالة ، يمكن إجراء حقن الفيروس المغطى باستخدام قضيب دقيق لإصابة اليرقات قبل بدء الفحص.

يجب تحديد عيار المخزون العامل للفيروس المتدفق باستخدام مقايسة البلاك أو فحوصات تخفيف نقطة النهاية. بالنسبة للتجارب الفسيولوجية ، ستكون الحقن خمسة في 10 إلى PFU الرابع لكل طعام خامس H VNS نموذجية. لبدء هذا الاختبار الحيوي ، قم بتحميل كل تخفيف للفيروس في حقنة بلاستيكية واحدة سم مكعب إلى حقنة هرقل بطرف إبرة حاد قياس 28.5 أو 32.

عادة ما يكون من واحد إلى ثلاثة ميكرولتر من محلول الفيروسات المنقط. مع عيار من 10 إلى السابع ، يمكن استخدام سالب 10 إلى الثامن لكل مليلتر لكل يرقات بحيث يكون تحميل 300 إلى 500 ميكرولتر في المحقنة كافيا لمعظم الأغراض. بعد ذلك ، قم بإخراج فقاعات الهواء من المحقنة عن طريق تثبيت المحقنة في وضع مستقيم لجلب الهواء إلى طرف الإبرة والاستغناء عنها.

ثم ثبت المحقنة على أنبوب دعم المحقنة. الآن اضبط مستوى الصوت على 1.0 ميكرولتر. لكل قطرة في وحدة التحكم في المعالج الدقيق للقضيب الصغير ، قم بمعايرة وحدة التحكم أولا للتأكد من الاستغناء عن الحجم الصحيح ، ويمكن ضبط السرعة التي يتم بها توزيع القطرة على مقياس من صفر إلى تسعة.

يشيع استخدام نطاق من صفر إلى واحد. اضغط على مفتاح القدم للتأكد من توزيع المحلول بشكل مناسب. تذكر أنه إذا تم الاستغناء عن الكثير من المحلول أو إذا كان التطبيق بطيئا جدا ، فيمكن ضبط إعدادات الصوت والسرعة حتى يتم تطبيق الحجم المناسب للمحلول بالمعدل الصحيح.

أنا الآن مستعد لبدء الحقن لعدوى H VNS. في وقت مبكر من الخامس ، عادة ما يتم حقن يرقات الطور ، حيث يسهل الحجم الأكبر للأطوار اللاحقة عملية الحقن. أدخل طرف الإبرة من خلال بلانة إحدى الأرجل الاحترافية وفي تجويف الجسم.

لاحظ ، عندما يتم إدخال طرف الإبرة في البرول ، قم بتغيير موضع جسم اليرقات لتجنب إتلاف جدار الأمعاء والجسم ، اضغط الآن على مفتاح القدم أربع مرات لتوصيل أربعة ميكرولترات من محلول الفيروس في ختم hemo. بعد اكتمال الحقن ، أعد جميع اليرقات إلى حاضنة 28 درجة مئوية. تحقق بشكل متكرر من اليرقات الميتة والتأكد من توفر نظام غذائي مناسب لليرقات الباقية.

على الرغم من أن الأطوار المتأخرة لا تموت من إصابة بشرة ناتجة عن الحقن ، إلا أنه لا يزال يتعين فحص اليرقات بعد 24 ساعة من الحقن في حالة تلف الأمعاء ، والذي قد ينتج عن عدوى بكتيرية. وينبغي استبعاد هذه الوفيات المبكرة من تحليل البيانات. في حالة استخدام الاختبار الحيوي بمساعدة القضيب الدقيق مع فيروس نطح للفحوصات الحيوية للتركيز المميت ، يجب تكرار المقايسة الحيوية ثلاث أو أربع مرات في مناسبات منفصلة.

استخدم 30 فردا لكل جرعة لكل فيروس أو علاج مكافح. استخدم برنامجا مناسبا لتحليل الوصايا مثل البولو أو SAS لحساب قيم lc 50 وفترات الثقة 95٪ والإحصاءات المناسبة. يمكن أيضا استخدام هذا المقايسة الحيوية لتحديد قيم وقت البقاء ST 50 بعد تلقيح جرعة ثابتة من الفيروس.

في هذه الحالة ، يتم تسجيل وفيات اليرقات كل أربع إلى ثماني ساعات مع ملاحظات أكثر تكرارا. إذا كان معدل الوفيات مرتفعا ، فإن متوسط أوقات البقاء على قيد الحياة في حدود الثقة 95٪ يتم حسابها باستخدام مقدر كابلان ماير باستخدام برنامج s plus أو SAS. الآن بعد أن أظهر لك Harran الاختبار الحيوي بمساعدة قضيب الصغير باستخدام فيروس نطح.

سأريكم الفحص. استخدام متعدد الوجوه يتم استخدام التلقيح الفموي للوجوه المتعددة الوجوه مباشرة في أمعاء الحشرات عندما يكون التوقيت الدقيق للعدوى أمرا بالغ الأهمية. على سبيل المثال ، عند مراقبة كيفية انتشار الفيروس داخل الحشرة لبدء هذا الفحص ، قم بتعليق متعدد الوجوه في محلول طافو محايد من ثلاثة إلى اثنين من الجلسرين والماء من 10 إلى 300.

يمكن استخدام متعدد الوجوه للطور الرابع ، على سبيل المثال. ثم قم بتحميل هذا المحلول في حقنة بلاستيكية أو زجاجية واحدة CC tuberculin بإبرة طرف حادة قياس 32. ضع المحقنة على أنبوب الدعم الخاص بقضيب الصغير مع النظر إلى المجهر.

أمسك الرابعة أو الخامسة في يرقة النجمة ، وأدخل الإبرة عبر الفم وفي المنطقة الأمامية من الأمعاء الوسطى ، ثم قم بتوصيل متعدد الوجوح. تتطلب هذه التقنية بعض الممارسة. أولا ، قد يكون من الصعب إمساك اليرقات بالقفازات دون سحقها.

ثانيا ، يتطلب الأمر بعض الممارسة للتنقل بالإبرة عبر أجزاء الفم. نوصيك بالتدرب على تلقيح حوالي 30 يرقة باستخدام PBS. إذا حدث ثقب القناة الهضمية ، فسيكون ذلك واضحا لأن اليرقات تتحول إلى اللون الأسود بسرعة كبيرة.

مرة أخرى ، نظرا لأن التلقيح الفموي بمساعدة قضيب دقيق يوفر الوقت المحدد للإصابة ، فإن هذه الطريقة مفيدة للغاية للتجارب التي يكون فيها وقت الإصابة مهما لتحديد كيفية انتشار الفيروس داخل الحشرة. على سبيل المثال ، يمكن تلقيح الفيروسات التي تعبر عن بيتا غالاكتوز dase عن طريق الفم في اليرقات ، والتي يتم تشريحها بعد ذلك في نقاط زمنية مختلفة لتحديد الأنسجة التي تصاب بالعدوى عندما سنعرض لك فقط اثنين من السفينتين بمساعدة قضيب دقيق للعدوى. حب الحشرات مع vir ، كان أولها التطعيم المباشر عبر pro Legg للفيروس المضرب ، وهذا يسمح لك بتجاوز فسيولوجيا الأمعاء وتقييم الفتك والوقت المميت للفيروس الذي تهتم به.

كانت التقنية الثانية هي التلقيح المباشر في الأمعاء الوسطى باستخدام متعدد الوجوح. يتيح لك ذلك توصيل جرعة دقيقة للغاية مباشرة إلى الأمعاء الوسطى ، بالإضافة إلى التحكم في توقيت دقيق للغاية للحدث. ثم يمكنك دراسة معدل الوفيات والأنماط الظاهرية الأخرى للفيروس أيضا.

عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الجثث التي يقتل فيروس باولا اليرقات عادة ما تكون هشة ويمكن أن تتمزق بسهولة إطلاق الفيروس. لذلك تعقيم أسطح العمل والتخلص من القفازات الملوثة والمواد التي تستخدم لمرة واحدة بطريقة مناسبة لمنع التلوث. هذا كل شيء.

شكرا لمشاهدتك. حظا سعيدا في تجربتك.