بروتوكولات لMicroapplicator بمساعدة العدوى من اليرقات Lepidopteran مع الفيروسة العصوية

بينما يُستخدم الفيروس العصوي (baculovirus) الخاص بالمفصليات كأداة بحثية قياسية لأنظمة التعبير عن البروتينات حقيقية النواة، فإنه يُطور أيضاً كعامل مبيد للحشرات آمن بيئياً، يمكنه القضاء على الحشرات العاشبة مثل حرشفية الأجنحة (lepidoptera) في الطبيعة. تُصاب يرقات حرشفية الأجنحة بالفيروسات العصوية عند تناول الأوراق المصابة؛ حيث تبتلع اليرقات أو الديدان الفيروس العصوي في شكل يُعرف باسم الجسم المتعدد السطوح (polyhedron)، وهو عبارة عن معقد من الجزيئات الفيروسية المغلفة في بنية بروتينية بلورية كبيرة تحمي الفيروس من الجفاف.

بمجرد إصابة اليرقة، ينتشر الفيروس في أنحاء جسم الحشرة. ويقوم الفيروس بتسخير آليات تخليق الأحماض النووية والبروتينات في المضيف لإنتاج المزيد من الفيروسات والأجسام المتعددة السطوح. وفي النهاية، تصبح اليرقات مصابة بالفيروس بشكل كامل لدرجة أنها تتحلل إلى مادة لزجة من الأجسام المتعددة السطوح التي تقطر على أسطح النباتات التي تتغذى عليها الحشرة، ومن ثم تبدأ الدورة من جديد، وذلك من أجل تحديد الفعالية المبيدة للحشرات لنوع معين من الـ Baca.

يمكن الجمع بين تقنيات المطبق الدقيق لسلالة Avir والمقايسات الحيوية. حيث يمكن إصابة يرقات Leid dorin عن طريق حقن الفيروسات مباشرة في HemosIL أو تجويف الجسم، ومن ثم تقييم معدلات الوفيات. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إصابة اليرقات بالأجسام متعددة السطوح (polyhedra) باستخدام الحقن بمساعدة المطبق الدقيق الفموي، كما يمكن قياس توقيت إصابة الأمعاء والأنسجة الأخرى.

أهلاً بكم، أنا ويندي سباركس من مختبر برايان بونينج في قسم علم الحشرات بجامعة ولاية أيوا، وأنا أيضاً من بونينج سناب. سنعرض لكم اليوم طريقتين لإصابة ذباب الفاكهة المختبري Drosophila melanogaster بفيروس backlog. تعتمد كلتا الطريقتين على استخدام المطبق الدقيق.

أولاً، سأوضح لكم كيفية استخدام المطبق الدقيق لإيصال الفيروس إلى التجويف الأنفي عبر المنخر. ثم سأوضح لكم كيفية استخدام المطبق الدقيق لإيصال الـ poly header إلى الجزء الأوسط من القناة السمعية عبر الفم. لذا، فلنبدأ.

عندما تُطوَّر فيروسات balo لأغراض مكافحة الحشرات، فإنها عادةً ما تحتوي على جين متعدد السطوح (polyhedron gene) لتسهيل العدوى الفموية ليرقات الآفات. ومع ذلك، تظهر أحياناً أسباب تدعو لاختبار فيروس baccala سلبي تعدد السطوح لمعرفة آثاره المحتملة كمبيد حشري أو لتجاوز أمعاء الحشرة. وفي هذه الحالة، يمكن إجراء حقن الفيروس المبتور باستخدام موزع دقيق لإصابة اليرقات قبل بدء المقايسة.

يجب تحديد عيار المخزون العامل للفيروس الملقح باستخدام مقايسة اللويحات أو مقايسات التخفيف النهائية. وبالنسبة للتجارب الفسيولوجية، تكون الحقنات النموذجية بمقدار 5 × 10⁴ PFU لكل عصب نجمي بطني (VNS) في طور النمو الخامس لـ H. لبدء هذا المقايسة الحيوية، يتم تحميل كل تخفيف للفيروس الملقح في سرنجة هاملتون بلاستيكية سعة 1 cc مع طرف إبرة حادة بقياس 28.5 أو 32.

عادةً ما يتم استخدام من 1 إلى 3 µL من محلول الفيروس المخفف، بعيار يتراوح من 10⁷ إلى 10⁸ لكل milliliter لكل يرقة، بحيث يكون تحميل 300 إلى 500 µL في المحقنة كافياً لمعظم الأغراض. بعد ذلك، يتم طرد فقاعات الهواء من المحقنة عن طريق إمساكها في وضع عمودي لجلب الهواء إلى طرف الإبرة ثم تفريغه.

ثم قم بتثبيت المحقنة على أنبوب دعم المحقنة. الآن اضبط الحجم على 1.0 µL. وبالنسبة لكل قطرة، قم بمعايرة وحدة التحكم في المعالج الدقيق لجهاز التطبيق الدقيق أولاً للتأكد من صرف الحجم الصحيح، ويمكن ضبط السرعة التي يتم بها صرف القطرة على مقياس من صفر إلى تسعة.

يُستخدم عادةً نطاق يتراوح من صفر إلى واحد. اضغط على مفتاح القدم للتأكد من صرف المحلول بشكل مناسب. تذكر أنه في حال صرف كمية زائدة من المحلول أو إذا كان التطبيق بطيئاً جداً، فيمكن ضبط إعدادات الحجم والسرعة حتى يتم تطبيق الحجم الصحيح من المحلول بالمعدل المناسب.

أنا الآن مستعدة لبدء عملية الحقن لإحداث عدوى H VNS. يتم عادةً حقن اليرقات في المرحلة المبكرة من الطور الخامس، حيث أن الحجم الأكبر في الأطوار المتأخرة يسهل عملية الحقن. أدخلي طرف الإبرة عبر باطن إحدى الأرجل الكاذبة وصولاً إلى تجويف الجسم.

ملاحظة، عند إدخال طرف الإبرة في الفتحة، قم بتغيير وضعية جسم اليرقة لتجنب إتلاف الأمعاء وجدار الجسم، ثم اضغط الآن على مفتاح القدم أربع مرات لحقن 4 µL من محلول الفيروس في الجيب الدموي. بعد اكتمال عمليات الحقن، أعد جميع اليرقات إلى الحاضنة عند درجة حرارة 28 °C. افحص اليرقات بشكل دوري للتأكد من عدم وجود يرقات ميتة ولضمان توفر نظام غذائي كافٍ لليرقات الناجية.

على الرغم من أن الأعمار اليرقية المتأخرة لا تموت بسبب إصابة القشيرة الناتجة عن الحقن، إلا أنه يجب فحص اليرقات بعد 24 ساعة من الحقن تحسباً لوجود تلف في المعى، والذي قد ينتج عن عدوى بكتيرية. ويجب استبعاد هذه الوفيات المبكرة من تحليل البيانات. في حال استخدام المقايسة الحيوية بمساعدة المطبق الدقيق مع الفيروس الملقح لمقايسات التركيز القاتل، يجب تكرار المقايسة الحيوية ثلاث أو أربع مرات في مناسبات منفصلة.

استخدم 30 فرداً لكل جرعة لكل فيروس أو معاملة ضابطة. استخدم برنامج تحليل احتمالات (probate analysis) مناسب مثل polo أو SAS لحساب قيم lc 50، وفترات الثقة 95%، والإحصائيات المناسبة. يمكن استخدام هذا المقايسة الحيوية أيضاً لتحديد قيم وقت البقاء ST 50 بعد تلقيح جرعة ثابتة من الفيروس.

في هذه الحالة، يتم تقييم معدل نفوق اليرقات كل أربع إلى ثماني ساعات مع إجراء ملاحظات أكثر تكراراً. وإذا كان معدل النفوق مرتفعاً، يتم حساب أوقات البقاء على قيد الحياة المتوسطة ضمن حدود ثقة 95% باستخدام مقدر كابلان-ماير عبر برنامج s plus أو SAS. لقد عرض لك هاران الآن المقايسة الحيوية بمساعدة المطبق الدقيق باستخدام فيروس التبرعم.

سأعرض لكم المقايسة. باستخدام الأجسام المتعددة السطوح، يُستخدم التلقيح الفموي للأجسام المتعددة السطوح مباشرة في أمعاء الحشرة عندما يكون التوقيت الدقيق للإصابة أمراً بالغ الأهمية. على سبيل المثال، عند مراقبة كيفية انتشار الفيروس داخل الحشرة؛ لبدء هذه المقايسة، قم بتعليق الأجسام المتعددة السطوح في محلول متعادل الطفو بنسبة 3:2 من الجلسرين والماء بتركيز من 10 إلى 300.

يمكن استخدام الأجسام المتعددة السطوح (Polyhedra) لتعزيز طور nymph الرابع، على سبيل المثال. بعد ذلك، يتم تحميل هذا المحلول في حقنة توبيركولين بلاستيكية أو زجاجية سعة 1 CC مع إبرة ذات سن غير حاد بمقياس 32 gauge. ثبّت الحقنة على أنبوب دعم المطبّق الدقيق أثناء النظر عبر المجهر.

أمسك اليرقة في الطور الرابع أو الخامس (مرحلة النجمة)، ثم أدخل الإبرة عبر الفم وصولاً إلى المنطقة الأمامية من المعي المتوسط، ثم قم بحقن الأجسام متعددة السطوح (polyhedra). تتطلب هذه التقنية بعض التدريب؛ ففي البداية، قد يكون من الصعب الإمساك باليرقات أثناء ارتداء القفازات دون سحقها.

ثانياً، يتطلب توجيه الإبرة لتجاوز أجزاء الفم بعض التدريب. نوصي بالتدرب على تلقيح حوالي 30 يرقة باستخدام PBS. وفي حال حدوث ثقب في الأمعاء، فسيكون ذلك واضحاً لأن اليرقات ستصاب بالتصبغ الميلانيني وتتحول إلى اللون الأسود بسرعة كبيرة.

ومرة أخرى، نظرًا لأن التلقيح الفموي بمساعدة المطبق الدقيق يوفر وقتًا دقيقًا للإصابة، فإن هذه الطريقة هي الأكثر فائدة في التجارب التي يكون فيها وقت الإصابة مهمًا لتحديد كيفية انتشار الفيروس داخل الحشرة. فعلى سبيل المثال، يمكن تلقيح اليرقات فمويًا بفيروسات تعبر عن إنزيم beta galactoses dase، ثم يتم تشريحها في نقاط زمنية مختلفة لتحديد الأنسجة التي تصاب بالعدوى. سنعرض لكم الآن وعاءين بمساعدة المطبق الدقيق للإصابة. الحشرات المصابة بالفيروس، حيث كان الأول منهما تلقيحًا مباشرًا عبر أرجل الساق الأمامية للفيروس الملقح، وهذا يسمح لكم بتجاوز فيزيولوجيا الأمعاء وتقييم الفتك والوقت المميت للفيروس الذي تهتمون بدراسته.

كانت التقنية الثانية هي التلقيح المباشر في المعي المتوسط باستخدام الأجسام المتعددة السطوح (polyhedra). وتتيح هذه الطريقة إيصال جرعة دقيقة للغاية مباشرة إلى المعي المتوسط، بالإضافة إلى التحكم الدقيق في توقيت الحدث. ومن ثم، يمكنك دراسة معدلات النفوق والأنماط الظاهرية الأخرى للفيروس أيضاً.

عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن اليرقات التي قتلتها فيروسات baula تكون عادةً هشّة ويمكن أن تتمزق بسهولة مما يؤدي إلى إطلاق الفيروس. لذا، قم بتعقيم أسطح العمل وتخلص من القفازات والمواد المستهلكة الملوثة بطريقة مناسبة لمنع حدوث التلوث. هذا كل شيء.

شكرًا للمشاهدة. تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجربتكم.