سيجما للنشاط غير محددة البروتياز الفحص -- باعتباره الركيزة الكازين

تكسر البروتياز روابط الببتيد في المختبر. غالبا ما يكون من الضروري قياس و / أو مقارنة نشاط البروتياز سيجما. يمكن استخدام مقايسة نشاط البروتياز العالمي كإجراء موحد لتحديد نشاط البروتياز ، وهو ما نقوم به أثناء إجراءات مراقبة الجودة لدينا.

في هذا الاختبار ، يعمل Casian كركيزة عندما يهضم البروتياز الذي نختبره كاسيان. يتم تحرير الحمض الأميني التيروزين مع الأحماض الأمينية الأخرى وشظايا الببتيد. ثم يتفاعل التيروزين الحر مع الفينول الساقط والأسطواني أو الكاشف الساقط لإنتاج كروموفور أزرق اللون ، والذي يمكن قياسه وقياسه كقيمة امتصاص على مقياس الطيف الضوئي.

كلما زاد عدد التيروزين الذي يتم إطلاقه من الكازيان ، زاد توليد الكروموفورات وكلما كان نشاط البروتياز أقوى ، تتم مقارنة قيم امتصاص البروتياز الناتجة عن نشاط البروتياز بمنحنى قياسي يتم إنشاؤه عن طريق تفاعل الكميات المعروفة من التيروزين مع كاشف FC لربط التغيرات في الامتصاص. مع كمية التيروزين في الميكرومول من المنحنى القياسي ، يمكن تحديد نشاط عينات البروتياز من حيث الوحدات ، وهي كمية ميكرومول مكافئ التيروزين المنبعثة من Cain في الدقيقة. مرحبا ، اسمي Carrie Cup Vineyard وأنا عالم في منشأة Sigma Aldridge DeKalb هنا في سانت لويس بولاية ميسوري.

اليوم ، سأوضح لك طريقة قابلة للتطبيق عالميا لاختبار نشاط البروتياز في Sigma Aldridge. نحن نستخدم هذا الاختبار بشكل أساسي في مجال مراقبة الجودة لدينا للتأكد من أن البروتياز لدينا لديه نشاط كاف قبل شحنه إليك مباشرة في مختبرك. قبل البدء في الفحص ، نحتاج إلى التأكد من أن الكواشف التالية معدة بشكل صحيح.

مخزن مؤقت لفوسفات البوتاسيوم 50 مليمولار ، درجة الحموضة 7.5. يتم وضع المحلول عند 37 درجة مئوية قبل استخدام محلول كاسيان من الوزن إلى الحجم بنسبة 0.65٪ المحضر عن طريق خلط 6.5 ملليغرام إلى مليلتر في لتر واحد. تزداد درجة حرارة المحلول تدريجيا مع التحريك اللطيف إلى 80 إلى 85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا حتى يتم تحقيق تشتت متجانس.

من المهم جدا عدم غلي المحلول. ثم يتم ضبط الرقم الهيدروجيني إذا لزم الأمر باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. محلول حمض ثلاثي كلورو أسيتيك 110 ملليمولار محضر عن طريق تخفيف مخزون عادي 6.1 ، نسبة واحدة إلى 55 بالماء النقي 0.5 ملليمولار ، كاشف الفينول الساقط والختم أو كاشف الفينول الساقط ، وهو الحل الذي سيتفاعل مع التيروزين لتوليد تغيير لون قابل للقياس.

سيكون ذلك مرتبطا ارتباطا مباشرا بنشاط البروتيازات. محلول كربونات الصوديوم 500 ملليمولار محضر باستخدام 53 ملليغرام إلى مليلتر من كربونات الصوديوم اللامائية في الماء النقي ، وهو محلول مخفف للإنزيم ، والذي يتكون من 10 ملليمولار أسيتات الصوديوم مع خمسة ملليمولار من الأس الهيدروجيني 7.5 عند 37 درجة مئوية. هذا الحل هو ما نستخدمه لإذابة عينات البروتياز الصلب أو تخفيف محاليل الإنزيم.

يتم تحضير محلول مخزون التيروزين القياسي L ، والذي يجب أن يكون بتركيز أولي يبلغ 1.1 ملليمولي ، محلول 0.2 ملليغرام إلى مليلتر من L tyrosine ، في ماء نقي ويسخن برفق حتى يذوب التيروزين. كما هو الحال مع الكازيان ، لا تغلي هذا المحلول. اترك معيار التيروزين L ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة.

سيتم تخفيف هذا المحلول بشكل أكبر لجعل منحنى القياسي الخاص بنا إذا لزم الأمر ، عينة بروتاز صلبة من النشاط المحدد مسبقا ، والتي يتم إذابتها باستخدام مخفف الإنزيم إلى 0.1 إلى 0.2 وحدة لكل مليلتر. يعمل هذا الحل كعنصر تحكم إيجابي لمقايسة مراقبة الجودة ، وكتحقق من صحة الحسابات ، سنقوم بإجراء لتحديد نشاط الإنزيم. والآن بعد أن أعددنا الكواشف ووصلت جميعها إلى درجة الحرارة الصحيحة، سنبدأ في اختبار البروتياز الخاص بنا.

لبدء هذا الفحص ، ابحث عن قوارير مناسبة تحتوي على حوالي 15 ملليلترا. لكل إنزيم ستختبره ، ستحتاج إلى أربع قوارير. سيتم استخدام قارورة واحدة كفارغة ، وسيتم استخدام ثلاثة أخرى لفحص نشاط ثلاثة.

يعد تخفيف البروتياز ثلاثي التخفيف مفيدا عند التحقق من حساباتنا النهائية مقابل بعضنا البعض لكل مجموعة من أربعة قوارير عند خمسة ملليلتر من محلول كاسيان 0.65٪ واتركها تتوازن في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا. ثم أضف تركيزات متفاوتة من محلول الإنزيم إلى ثلاثة من قوارير عينة الاختبار ، ولكن ليس الفارغة. امزجها عن طريق التحريك واحتضانها لمدة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بالضبط.

نشاط البروتياز وما يترتب على ذلك من تحرير التيروزين خلال فترة الحضانة هذا هو ما سيتم قياسه ومقارنته بين عينات الاختبار لدينا. بعد هذه الحضانة لمدة 10 دقائق ، أضف خمسة ملليلتر من كاشف TCA إلى كل أنبوب. ثم يضاف حجم مناسب من محلول الإنزيم إلى كل أنبوب ، حتى الفراغ ، بحيث يكون الحجم النهائي لمحلول الإنزيم في كل أنبوب مليلتر واحدا.

يتم ذلك لحساب قيمة امتصاص الإنزيم نفسه. الآن احتضان المحاليل عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. خلال هذه الحضانة التي تبلغ مدتها 30 دقيقة ، قد ترغب في إعداد تخفيفات التيروزين القياسية ، والتي تتم باستخدام ست قوارير DR.

يمكن أن يحمل بسهولة ثمانية ملليلتر للقوارير الستة. تتم إضافة محاليل ساق التيروزين القياسية 1.1 مللي مولار بالأحجام التالية بالملليلتر 0.05 و 0.1 و 0.2 و 0.4 و 0.5. لا تضيف أي معيار تيروزين إلى الفراغ.

قد تكون هناك حاجة إلى معايير أقل لعينات اختبار IPU التي ستؤدي إلى تغيير بسيط في اللون. بمجرد إضافة محلول التيروزين القياسي ، أضف حجما مناسبا من الماء النقي إلى كل من المعايير لرفع الحجم إلى ملليلتر. بعد الحضانة ، قم بتصفية كل من حلول الاختبار والفراغ.

باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرون ، تتم إضافة ملليلترين من عينات الاختبار والمرشح الفارغ إلى أربع قوارير DR يمكنها استيعاب ثمانية ملليلتر على الأقل. يمكنك استخدام نفس النوع من القارورة التي تم فيها إعداد المعايير لجميع القوارير التي تحتوي على المعايير وإضافة خمسة ملليلتر من كربونات الصوديوم القياسية الفارغة ، وللحصول على أفضل النتائج ، تتم إضافة الكاشف الساقط بعد ذلك مباشرة ، ثم تضاف كربونات الصوديوم إلى عينات الاختبار الخاصة بنا وتختبر فارغة. ستلاحظ أن هذه المحاليل تصبح غائمة بعد إضافة كربونات الصوديوم.

ثم يضاف الكاشف الساقط ، والذي سيتفاعل مع التيروزين الحر. ثم يتم خلط قوارير DRAM عن طريق الدوران وتحضينها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بعد هذه الحضانة. يجب أن تلاحظ أن المعايير لها تدرج في اللون يرتبط بكمية التيروزين المضافة ، وأعلى تركيزات من التيروزين تبدو أغمق.

يمكنك أيضا ملاحظة تغير ملحوظ في اللون في عينات الاختبار الخاصة بنا. يتم ترشيح ملليلترين من هذه المحاليل باستخدام مرشح حقنة 0.45 ميكرون وكوفيت مناسب. والآن بعد أن انتهينا من المقايسة، لننتقل إلى مقياس الطيف الضوئي ونسجل قيم الامتصاص.

يتم قياس امتصاص عيناتنا بواسطة مقياس الطيف الضوئي باستخدام طول موجي يبلغ 660 نانومتر. يتم ضبط مسار الضوء على سجل سنتيمتر واحد ، وقيم الامتصاص لمعيار المعايير فارغة ، وعينات الاختبار المختلفة واختبار فارغ. بمجرد جمع جميع البيانات ، نكون مستعدين لإنشاء منحنى قياسي.

من أجل توليد فرق المنحنى في الامتصاص بين الفراغ القياسي والقياسي يجب حسابها. هذه هي قيمة الامتصاص التي تعزى إلى كمية التيروزين في المحاليل القياسية. بعد الحساب البسيط، نخلق المنحنى المعياري من خلال رسم التغير في امتصاص معاييرنا على المحور Y مقابل الكمية بالميكرومول لكل من معاييرنا الخمسة على المحور x.

بمجرد إدخال نقاط البيانات الخاصة بنا ، وإنشاء أفضل خط ملاءمة ، ثم نجد التغيير في الامتصاص في عينات الاختبار الخاصة بنا عن طريق حساب الفرق بين امتصاص عينة الاختبار وامتصاص الاختبار الفارغ. بالنظر إلى المنحنى القياسي ، نحدد قيمة الامتصاص لإحدى عينات الاختبار في المحور Y. والآن نتحرك بالتوازي مع المحور X، نرسم خطا ونتوقف عند النقطة التي نصل فيها إلى المنحنى القياسي.

ثم من إحداثي X المأخوذ في هذه المرحلة، نحصل على كمية التيروزين ومولات صغيرة تم تحريرها أثناء هذا التفاعل المحلل للبروتين. للحصول على نشاط الإنزيم بوحدات لكل مليلتر ، قم بإجراء الحساب التالي ، خذ عدد مكافئات التيروزين الصغيرة التي تم إطلاقها ، والتي تم الحصول عليها من المنحنى القياسي واضربها في الحجم الكلي للمقايسة بالملليلتر ، والتي في حالتنا هي 11 ملليلترا. ثم اقسم هذه القيمة على ثلاث كميات أخرى.

وقت الفحص ، الذي أجريناه لمدة 10 دقائق ، حجم الإنزيم المستخدم في الفحص ، والذي كان متنوعا. لنستمع مليلتر واحد. حجم المليلتر المستخدم في الكشف عن الكلور المتري ، والذي قد يختلف بناء على الطبيب البيطري Q.

نستخدم ملليلترين. يمنحنا ميكرومول التيروزين مقسوما على الوقت بالدقائق قياسنا لنشاط البروتياز الذي نسميه الوحدات. يمكننا إلغاء وحدات قياس الحجم في البسط والمقام، ومن ثم يتبقى لنا قياس نشاط الإنزيم من حيث الوحدات لكل ملليلتر.

لتحديد النشاط في عينة البروتياز الصلب المخفف في مادة مخففة للإنزيم، نقسم نشاطنا بوحدات لكل مليلتر على تركيز المادة الصلبة المستخدمة في هذا المفحص في الأصل بالملليغرام لكل مليلتر، مما يترك لنا نشاطا. من حيث الوحدات لكل مليغرام ، أوضحنا لك للتو كيفية تحليل نشاط البروتياز باستخدام مقايسة نشاط البروتياز العالمي من Sigma. كما رأيت عند القيام بهذا الإجراء ، من الأهمية بمكان أن تتذكر تسخين كل من محاليل الكازيان والتيروزين ببطء وعدم غليها.

أيضا ، من الأهمية بمكان إعداد فراغات مختلفة لكل من معاييرك ولكل عينة اختبار لديك. هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في أنشطة البروتياز الخاصة بك.