سيجما للنشاط غير محددة البروتياز الفحص -- باعتباره الركيزة الكازين

تعمل البروتيازات على تكسير الروابط الببتيدية في المختبر. وغالباً ما يكون من الضروري قياس أو مقارنة نشاط البروتيازات. ويمكن استخدام مقايسة نشاط البروتياز الشاملة من شركة Sigma كإجراء معياري لتحديد نشاط البروتيازات، وهو ما نقوم به خلال إجراءات مراقبة الجودة لدينا.

في هذا المقايسة، يعمل الكازين كركيزة عندما يقوم البروتياز الذي نختبره بهضم الكازين. ويؤدي ذلك إلى تحرير الحمض الأميني تيروزين إلى جانب أحماض أمينية أخرى وشظايا ببتيدية. يتفاعل التيروزين الحر بعد ذلك مع كاشف فولر وكالسيوم فينول أو كاشف فولر لإنتاج كروموفور أزرق اللون، وهو أمر قابل للقياس الكمي ويُقاس كقيمة امتصاص على جهاز المطياف الضوئي.

كلما زادت كمية التيروزين المتحررة من الكازين، زاد توليد حاملات الألوان وزاد نشاط البروتياز. وتتم مقارنة قيم الامتصاص الناتجة عن نشاط البروتياز بمنحنى قياسي يتم إنشاؤه عن طريق تفاعل كميات معروفة من التيروزين مع كاشف FC لربط التغيرات في الامتصاص. وبناءً على كمية التيروزين بالميكرومول المستخلصة من المنحنى القياسي، يمكن تحديد نشاط عينات البروتياز من حيث الوحدات، والتي تمثل كمية الميكرومولات من مكافئ التيروزين المتحررة من الكازين في الدقيقة. مرحباً، اسمي كاري كوب فينيارد، وأنا عالمة في منشأة سيجما ألدريتش ديكالب هنا في سانت لويس، ميزوري.

سأوضح لكم اليوم طريقة قابلة للتطبيق عالمياً لاختبار نشاط البروتياز في Sigma Aldridge. نستخدم هذا المقايسة بشكل أساسي في قسم مراقبة الجودة لدينا للتأكد من أن البروتياز يتمتع بنشاط كافٍ قبل شحنه مباشرة إلى مختبراتكم. وقبل البدء في المقايسة، نحتاج إلى التأكد من تحضير الكواشف التالية بشكل صحيح.

محلول منظم من فوسفات البوتاسيوم بتركيز 50 millimolar، وpH 7.5. يتم وضع المحلول عند درجة حرارة 37 degrees Celsius قبل الاستخدام، ومحلول kasian بتركيز 0.65% وزن/حجم تم تحضيره بخلط 6.5 milligrams إلى milliliters في لتر واحد. يتم رفع درجة حرارة المحلول تدريجيًا مع التحريك اللطيف لتصل إلى 80 إلى 85 degrees Celsius لمدة 10 minutes تقريبًا حتى يتم الحصول على تشتت متجانس.

من المهم جداً عدم غلي المحلول. بعد ذلك، يتم ضبط الـ pH إذا لزم الأمر باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. محلول حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك بتركيز 110 millimolar يتم تحضيره عن طريق تخفيف مخزون بتركيز 6.1 normal بنسبة 1 إلى 55 باستخدام ماء منقى، و0.5 millimolar من كاشف fallen and seal calts أو fallen phenol، وهو المحلول الذي سيتفاعل مع التيروزين لإحداث تغيير لوني يمكن قياسه.

سيكون ذلك مرتبطاً بشكل مباشر بنشاط البروتياز. يتم تحضير محلول كربونات الصوديوم بتركيز 500 millimolar باستخدام 53 mg/mL من كربونات الصوديوم اللامائية في ماء منقى، ومحلول مخفف للإنزيم يتكون من محلول منظم من خلات الصوديوم بتركيز 10 millimolar مع 5 millimolar كالسيوم عند pH 7.5 ودرجة حرارة 37 °C. هذا المحلول هو ما نستخدمه لإذابة عينات البروتياز الصلبة أو تخفيف محاليل الإنزيمات.

يتم تحضير المحلول المخزون القياسي لـ L tyrosine، والذي يجب أن يكون بتركيز أولي قدره 1.1 millimolar، وهو عبارة عن محلول L tyrosine بتركيز 0.2 milligram إلى milliliter، في ماء منقى ويُسخن بلطف حتى يذوب الـ tyrosine. وكما هو الحال مع الـ casein، يجب عدم غلي هذا المحلول. يُترك المحلول القياسي لـ L tyrosine ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة.

سيتم تخفيف هذا المحلول بشكل أكبر لإعداد منحنى القياس الخاص بنا إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام عينة بروتياز صلبة ذات نشاط محدد مسبقاً، تذاب باستخدام مخفف الإنزيم لتصل إلى 0.1 إلى 0.2 وحدة لكل ملليلتر. يعمل هذا المحلول كضابط موجب لاختبار مراقبة الجودة، وكتحقق من الحسابات التي سنجريها لتحديد نشاط الإنزيم. والآن بعد أن قمنا بتحضير الكواشف وأصبحت جميعها في درجة الحرارة الصحيحة، سنبدأ في اختبار البروتياز.

لبدء هذا المقايسة، ابحث عن قوارير مناسبة تتسع لحوالي 15 milliliters. ستحتاج إلى أربع قوارير لكل إنزيم ستقوم باختباره؛ حيث ستُستخدم قارورة واحدة كعينة فارغة (blank)، بينما تُستخدم القوارير الثلاث الأخرى لمقايسة نشاط ثلاثة.

تعتبر تخفيفات البروتياز الثلاثة مفيدة عند مراجعة حساباتنا النهائية ومقارنتها ببعضها البعض؛ لذا أضف 5 mL من محلول الكازين بتركيز 0.65% إلى كل مجموعة مكونة من أربعة أنابيب، واتركها لتصل إلى حالة التوازن في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة خمس دقائق تقريباً. بعد ذلك، أضف تركيزات متفاوتة من محلول الإنزيم إلى ثلاثة من أنابيب العينات الاختبارية، باستثناء الأنبوب الفارغ (blank). اخلطها عن طريق التدوير، ثم قم بتحضينها عند درجة حرارة 37 °C لمدة 10 دقائق بالضبط.

إن نشاط البروتياز وما يترتب عليه من تحرر للتيروسين خلال فترة الحضن هذه هو ما سيتم قياسه ومقارنته بين عينات الاختبار. بعد فترة الحضن التي تستغرق 10 دقائق، أضف خمسة ملليلتر من كاشف TCA إلى كل أنبوب. بعد ذلك، يتم إضافة حجم مناسب من محلول الإنزيم إلى كل أنبوب، بما في ذلك أنبوب العينة الفارغة (blank)، بحيث يكون الحجم النهائي لمحلول الإنزيم في كل أنبوب ملليلتر واحد.

يتم إجراء ذلك لأخذ قيمة امتصاص الإنزيم نفسه في الاعتبار. الآن، قم بحضن المحاليل عند 30 °C لمدة 30 دقيقة. خلال فترة الحضن هذه التي تستغرق 30 دقيقة، يمكنك البدء في تحضير تخفيفات تيروزين القياسية، والتي يتم إجراؤها باستخدام ستة من قوارير DR.

يمكن لذلك أن يتسع بسهولة لثمانية مليلترات في القوارير الست. تُضاف محاليل التيروزين القياسية بتركيز 1.1 millimolar بالأحجام التالية بالمليلتر: 0.05، و0.1، و0.2، و0.4، و0.5. لا تضف أي تيروزين قياسي إلى العينة الفارغة (blank).

قد تكون هناك حاجة إلى معايير أقل تركيزاً لعينات اختبار IPU التي ستؤدي إلى تغير طفيف في اللون. وبمجرد إضافة محلول تيروزين القياسي، أضف حجماً مناسباً من الماء المُنقى إلى كل من المعايير ليصل الحجم إلى 2 mL. وبعد فترة الحضانة، قم بترشيح كل من محلول الاختبارات والمحلول الخالي (blank).

باستخدام مرشح حقنة بمسامية 0.45 ميكرون، يتم إضافة مليليترين من عينات الاختبار والراشح الفارغ إلى أربعة من قوارير DR التي تتسع لثمانية مليليترات على الأقل. يمكنك استخدام نفس نوع القوارير التي حُضّرت فيها المحاليل القياسية لجميع القوارير التي تحتوي على المعايير والفراغ القياسي، حيث يتم إضافة خمسة مليليترات من كربونات الصوديوم، وللحصول على أفضل النتائج، يُضاف الكاشف المذكور فوراً بعد ذلك. ثم تُضاف كربونات الصوديوم إلى عينات الاختبار والفراغ الخاص بالاختبار. ستلاحظ أن هذه المحاليل تصبح عكرة بعد إضافة كربونات الصوديوم.

بعد ذلك، يتم إضافة الكاشف المترسب، والذي سيتفاعل مع التيروزين الحر. ثم تُخلط قوارير DRAM عن طريق التدوير وتُحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بعد هذه الحضنة. يجب أن تلاحظ أن المعايير تظهر تدرجاً في اللون يتناسب مع كمية التيروزين المضافة، حيث تظهر أعلى تركيزات التيروزين باللون الأكثر دكنة.

يمكنكم أيضاً ملاحظة تغير ملموس في اللون في عينات الاختبار الخاصة بنا. يتم ترشيح 2 mL من هذه المحاليل باستخدام مرشح حقنة بمسامية 0.45 micron وكوفيت مناسبة. والآن بعد أن انتهينا من المقايسة، لننتقل إلى جهاز المطياف الضوئي ونسجل قيم الامتصاصية.

يتم قياس الامتصاصية لعيناتنا بواسطة مقياس الطيف الضوئي باستخدام طول موجي قدره 660 nanometers. يتم ضبط مسار الضوء على واحد centimeter، ثم تُسجل قيم الامتصاصية للمحاليل القياسية، والعينة الضابطة (blank)، وعينات الاختبار المختلفة، وعينة الاختبار الضابطة. وبمجرد جمع كافة البيانات، نصبح مستعدين لإنشاء المنحنى القياسي.

من أجل إنشاء المنحنى، يجب حساب الفرق في الامتصاصية بين المحلول القياسي والمحلول الخالي من المادة القياسية (standard blank). تمثل هذه القيمة امتصاصية التيروزين الموجود في المحاليل القياسية. وبعد إجراء هذه الحسبة البسيطة، نقوم بإنشاء المنحنى القياسي عن طريق رسم التغير في الامتصاصية للمحاليل القياسية على محور Y مقابل الكمية بالميكرومول لكل من المحاليل القياسية الخمسة على محور x.

بمجرد إدخال نقاط البيانات الخاصة بنا وإنشاء خط الملاءمة الأفضل، نحدد التغير في الامتصاصية في عينات الاختبار من خلال حساب الفرق بين امتصاصية عينة الاختبار وامتصاصية العينة الفارغة (blank) الخاصة بها. وبالنظر إلى المنحنى القياسي، نحدد قيمة الامتصاصية لإحدى عينات الاختبار على محور Y. ثم نتحرك بشكل موازٍ لمحور X، حيث نرسم خطاً ونتوقف عند النقطة التي يتقاطع فيها مع المنحنى القياسي.

بعد ذلك، ومن إحداثي X المأخوذ عند هذه النقطة، نحصل على كمية وميكرومولات التيروزين المتحررة خلال هذا التفاعل البروتيني المحدد. ولحساب نشاط الإنزيم بوحدات لكل مليلتر، قم بإجراء العملية الحسابية التالية: خذ عدد مكافئات ميكرومولات التيروزين المتحررة، والتي تم الحصول عليها من المنحنى القياسي، واضربه في الحجم الكلي للمقايسة بالمليلتر، وهو في حالتنا هذه 11 milliliters. ثم اقسم هذه القيمة على ثلاث كميات أخرى.

وقت المقايسة، والتي أجريناها لمدة 10 minutes، وحجم الإنزيم المستخدم في المقايسة، والذي تم تغييره؛ لنستخدم 1 mL. أما حجم الـ milliliters المستخدم في الكشف اللوني، فقد يختلف بناءً على جهاز Q vet الخاص بك.

نستخدم مليلترين. وبقسمة ميكرومولات التيروزين على الزمن بالدقائق، نحصل على قياس لنشاط البروتياز نطلق عليه اسم الوحدات. ويمكننا شطب وحدات قياس الحجم في البسط والمقام، وبالتالي يتبقى لدينا قياس لنشاط الإنزيم بدلالة الوحدات لكل مليلتر.

من أجل تحديد النشاط في عينة بروتياز صلبة مُخففة في مُخفف الإنزيم، نقوم بقسمة النشاط بوحدة units per milliliter على تركيز المادة الصلبة المستخدمة في هذا المقايسة أصلاً بوحدة mg/mL، مما يعطينا النشاط بوحدة units per milligram. لقد استعرضنا للتو كيفية تحليل نشاط البروتياز باستخدام مقايسة نشاط البروتياز العامة من شركة Sigma. وكما رأيتم عند تنفيذ هذا الإجراء، فمن الضروري جداً تذكر تسخين كل من محاليل الكازين والتيروزين ببطء وعدم تركها تصل إلى درجة الغليان.

علاوة على ذلك، من الضروري تحضير عينات ضابطة (blanks) مختلفة لكل من المحاليل القياسية ولكل عينة اختبار لديك. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في قياس أنشطة البروتياز.