Name: سيجما للنشاط غير محددة البروتياز الفحص -- باعتباره الركيزة الكازين (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: تعلم قياس نشاط البروتياز باستخدام الكازين كركيزة وتحرير التيروزين كمؤشر. تُستخدم هذه الطريقة الموحدة للتحكم في الجودة المخبرية وضمان فعالية إنزيمات البروتياز.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

قبل البدء في عملية الفحص ، ونحن بحاجة للتأكد من أن يتم إعداد بشكل صحيح الكواشف التالية : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفوسفات البوتاسيوم 50 ملي العازلة ، ودرجة الحموضة 7.5. يعد استخدام 11.4 ملغ / مل من ثنائي القاعدة phospate البوتاسيوم ، هيدرات في تنقية المياه وتعديل درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك 1M. يتم وضع هذا الحل في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A 0.65 ٪ حل الكازين الوزن / الحجم ، التي أعدها خلط 6،5 ملغ / مل من الكازين في المنطقة العازلة 50 مم فوسفات البوتاسيوم. زيادة درجة الحرارة تدريجيا مع التحريك حل لطيف 80-85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا حتى يتم التوصل إلى تشتت متجانسة. فمن المهم جدا ألا يغلي الحل. ثم يتم تعديل درجة الحموضة إذا لزم الأمر مع هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A 110 ملي حل حمض حمض التريكلوروسيتيك ، التي أعدها تمييع a 1:55 الأسهم 6.1N مع تنقية المياه. حمض التريكلوروسيتيك حمض هو حمض قوي ، وينبغي التعامل معها بحذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 مم و فولين Ciolcaltea ، أو الكاشف فولين الفينول ، والذي هو الحل الذي سوف تتفاعل مع التيروزين لتوليد تغيير لون قياسها التي من شأنها أن تكون ذات صلة مباشرة الى نشاط البروتياز. الكاشف فولين هو حمض الفينول ، وينبغي التعامل معها بحذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والصوديوم 500 مم حل كربونات ، أعدت باستخدام 53 ملغم / لتر من كربونات الصوديوم في المياه النقية anyhydrous. حلا مخفف الانزيم الذي يتكون من 10 ملي خلات الصوديوم العازلة مع خلات الكالسيوم 5mm ، و 7.5 درجة الحموضة ، في 37 درجة مئوية. هذا الحل هو ما نستخدمه لإذابة العينات البروتيني صلبة أو تمييع حلول الانزيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L - 1.1 ملم التيروزين محلول المخزون قياسي. أعدت باستخدام 0.2 ملغ / مل L - التيروزين في تنقية المياه وتسخينها برفق حتى يذوب التيروزين. كما هو الحال مع الكازين ، لا تغلي هذا الحل. يسمح المعيار L - التيروزين لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. وسوف تضعف هذا الحل أخرى لجعل منحنى لدينا القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتيني الحل. على الفور قبل استخدامه ، ويحل في محلول مخفف البروتيني الانزيم أعد في الخطوة 6. </li></ol> إذا كان ذلك ضروريا ، واستخدام عينة صلبة من نشاط الأنزيم البروتيني محددة سلفا ، والتي حلت به مخفف لانزيم 0،1-0،2 وحدة / مل. هذا الحل بمثابة مراقبة إيجابية على جودة الفحص والرقابة والتحقق من صحة الحسابات ونحن سوف تؤدي إلى تحديد نشاط انزيم. إعداد الفحص البروتياز والمنحنيات القياسية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنبدأ هذا الاختبار ، والعثور على قنينة المناسبة التي ستعقد حوالي 15 مليليتر. لكل الانزيم الذي سيتم اختباره ، وهناك حاجة إلى 4 قوارير. وسيتم استخدام قارورة واحدة باعتبارها فارغة ، وسيتم استخدام ثلاثة آخرين لفحص النشاط ثلاثة من التخفيفات البروتيني. التخفيفات ثلاثة مفيدة عند فحص الحسابات النهائية ضد بعضها البعض. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على كل مجموعة من أربع قوارير ، إضافة 5mls من حلنا الكازين 0.65 ٪. دعوهم توازن في حمام مائي عند 37 لمدة 5 دقائق درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة أحجام متفاوتة حل الانزيم الذي سيتم اختبار لثلاث من قوارير عينة الاختبار ، ولكن ليس فارغا. مزيج من قبل دوامات واحتضان لمدة 37 درجة مئوية لمدة عشر دقائق بالضبط. نشاط الأنزيم البروتيني والتحرر من التبعية التيروزين خلال هذه الفترة الحضانة هو ما سيتم قياس ومقارنة بين عينات الاختبار. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد هذا الاحتضان 10 دقيقة ، إضافة ملل 5 من كاشف TCA إلى كل أنبوب لمنع رد الفعل. ثم ، إضافة حجم مناسب لانزيم حل لكل أنبوب ، حتى فارغة ، بحيث الحجم النهائي من الحل الانزيم في كل أنبوب 1 مل. يتم ذلك لحساب قيمة الامتصاصية للانزيم نفسها ، لضمان أن حجم النهائي في كل أنبوب هو على قدم المساواة. احتضان الحلول في 37 دقيقة لمدة 30 درجة مئوية. خلال هذه الحضانة لمدة 30 دقيقة ، قد تحتاج لإعداد المعيار الخاص التخفيفات التيروزين. 6 الدرام استخدام قوارير (يمكن استبداله قارورة الدرام مع أنابيب البولي بروبلين) التي يمكن أن تعقد بسهولة 8 ملل. الى قارورة ستة إضافة 1.1 ملم التيروزين الحلول الأسهم القياسية مع وحدات التخزين التالية في ملل : 0.05 ، 0.10 ، 0.20 ، 0.40 ، 0.50. لا تضف أي معيار التيروزين إلى فارغة. قد تكون هناك حاجة لخفض معايير اختبار عينات من النجاسة التي سوف تسفر قليلا تغيير اللون. مرة واحدة تم إضافة حل التيروزين القياسية ، إضافة حجم مناسب من الماء النقي الى كل من معايير لتحقيق وحدة التخزين إلى 2 ملل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة لمدة 30 دقيقة ، كل مرشح للحلول اختبار فارغة وباستخدام حقنة 0.45 ميكرون polyethersulfone التصفية. مطلوب الترشيح لإزالة أي insolubles من العينات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ترشيح 2 ملل من عينات الاختبار والترشيح للقوارير فارغة الدرام 4 التي يمكن أن تعقد ما لا يقل عن 8 ملل. ويمكن استخدام نفس النوع من القنينة التي أعدت المعايير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل من قوارير تحتوي على المعايير القياسية ، وفارغة ، إضافة 5mls من كربونات الصوديوم. للحصول على أفضل النتائج ، إضافة 1 مل من كاشف فولين بعد ذلك على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كربونات الصوديوم لتنظيم أي انخفاض الرقم الهيدروجيني إنشاؤها بواسطة إضافة كاشف للفولين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كربونات الصوديوم للعينات الاختبار والاحصائيينر فارغة. هذه الحلول يصبح غائما بعد إضافة كربونات الصوديوم. إضافة كاشف للفولين ، والتي سترد في المقام الأول مع التيروزين الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج قارورة الدرام التي تدور في احتضان و37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li></ol> بعد هذه الحضانة ، يجب أن تلاحظ أن معايير لها تدرج اللون رابطا مع مبلغ من التيروزين المضافة ؛ أعلى تركيزات التيروزين أحلك الظهور. يمكنك تلاحظ أيضا تغيير لون ملموس في عينات الاختبار. 2mls يتم تصفيتها من هذه الحلول باستخدام حقنة 0.45 polyethersulfone أم تصفية في cuvettes مناسبة. والآن بعد أن يتم تنفيذ الفحص ، يمكنك الشروع في معمل لتسجيل القيم الامتصاصية لدينا. </li></ol> قياس وحساب امتصاص نشاط انزيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قياس الامتصاصية للعينات من قبل معمل باستخدام الطول الموجي 660nm. يتم تعيين مسار الضوء ل1cm. سجل القيم الامتصاصية للمعايير وفارغ القياسية ، واختبار عينات مختلفة ، واختبار فارغة. مرة واحدة وقد تم جمع كافة البيانات ، يمكن إنشاء منحنى القياسية. يجب أن تكون محسوبة من أجل توليد المنحنى ، الاختلاف في الامتصاصية بين فارغة القياسية والمعايير. هذه هي القيمة التي تعزى إلى امتصاص كمية التيروزين في الحلول القياسية. بعد هذه العملية الحسابية البسيطة ، وخلق منحنى قياسي باستخدام برنامج الرسوم البيانية لرسم التغير في الامتصاصية من معاييرنا على المحور Y ، مقابل المبلغ المذكور في micromoles لكل من المعايير لدينا 5 على المحور X. <table style="width: 416px; height: 118px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> حجم قياسي التيروسين </th><th style="text-align:center"> uMoles التيروسين </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.05 </td><td style="text-align:center"> 0،055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.10 </td><td style="text-align:center"> 0،111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.20 </td><td style="text-align:center"> 0،221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.40 </td><td style="text-align:center"> 0،442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.50 </td><td style="text-align:center"> 0،553 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم إدخال نقاط البيانات ، إنشاء خط لأفضل لائقا والمناظرة المعادلة المنحدر. العثور على التغير في الامتصاصية في اختبار العينات عن طريق حساب الفرق بين عينة اختبار الامتصاصية والامتصاصية لاختبار فارغة. وإدراج قيمة الامتصاصية لأحد عينات اختبار في المعادلة المنحدر وحل النتيجة في micromoles المحررة من خلال هذا التفاعل التيروزين بروتين معين. للحصول على نشاط انزيم في وحدة في / مل ، وإجراء العملية الحسابية التالية : (المعادل التيروزين umole أفرج) × (11) وحدة / مل = أنزيم _________________________ (1) × (10) × (2) 11 = الحجم الكلي (في مل) من مقايسة 10 = وقت مقايسة (بالدقائق) وفقا لتعريف وحدة 1 = حجم استخدام انزيم (في مل) من أنزيم 2 = المجلد (في ملليلتر) المستخدمة في تحديد اللونية اتخاذ عدد من مكافئات micromoles التيروزين سراح الحصول عليها من معادلة الانحدار واضربها في الحجم الكلي للمقايسة في ملل ، والذي هو في حالتنا 11mls. تقسيم هذه القيمة من قبل ثلاثة كميات أخرى : الوقت للمقايسة ، والتي ركضنا لمدة 10 دقيقة ، وحجم انزيم المستخدمة في فحص ، الذي كان المتنوعة (دعونا نستخدم 1ml) ، وحجم ملليلتر المستخدمة في الكشف عن اللونية ، والتي قد تختلف استنادا كفيت الخاص. كنا 2 ملل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micromoles من التيروزين مقسوما الوقت في قياس عوائد دقيقة من النشاط البروتيني يسمى &quot;الوحدات الخاصة&quot;. يمكننا أن يلغي وحدة لقياس الحجم في البسط والمقام ، وترك قيس من نشاط انزيم من حيث وحدة / مل. من أجل تحديد نشاط الأنزيم البروتيني في عينة صلبة مخففة في انزيم مخفف ، نقسم نشاطنا في وحدة / مل من تركيز المواد الصلبة المستخدمة في هذا الاختبار في الأصل ملغ / مل. ، وترك لنا مع النشاط من حيث وحدة / ملغ . وحدة / مل انزيم الوحدات / الصلبة ملغ = _____________________ ملغ الصلبة / انزيم مل </li></ol>

<ol><li>Anson, M. L. J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li>
<li>Folin, O., Ciocalteau, V. J. Biol. Chem. 73, 627- (1929).</li>
</ol>

لقد أظهرنا لكم فقط كيفية تحليل نشاط الأنزيم البروتيني باستخدام سيغما نشاط الأنزيم البروتيني مقايسة عالمية. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الاختبار هو مفيد للتأكد من أن لدينا البروتياز تحدد بدقة النشاط قبل الحصول عليها عن تجاربك. كما رأيتم ، عند القيام بهذا الإجراء ، فإنه من الأهمية بمكان أن نتذكر أن كلا من الحرارة الكازين والحلول التيروزين ببطء وعدم سلقها. أيضا ، من المهم جدا لإعداد الفراغات المختلفة لكل من المعايير الخاصة بك ولكل عينة الاختبار التي لديك.

<table><tbody><tr><td>بروتياز (Protease)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4630</td><td></td></tr><tr><td>فوسفات البوتاسيوم، ثنائي القاعدة، ثلاثي الهيدرات</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>كازين (Casein)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>كاشف الفينول الخاص بـ Folin &amp;amp; Ciocalteu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9252</td><td></td></tr><tr><td>كربونات الصوديوم، لامائية</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td></td></tr><tr><td>أسيتات الصوديوم، ثلاثي الهيدرات</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8625</td><td></td></tr><tr><td>أسيتات الكالسيوم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1000</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine، قاعدة حرة</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>طقم تحليل البروتياز (Protease Profiler Kit)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PP0500</td><td></td></tr><tr><td>طقم الكشف الفلوري عن البروتياز</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PF0100</td><td></td></tr></tbody></table>

سيجما للنشاط غير محددة البروتياز الفحص -- باعتباره الركيزة الكازين

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

البروتياز كسر سندات ببتيد. في المختبر ، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لقياس و / أو مقارنة نشاط البروتياز. ويمكن استخدام سيجما نشاط الأنزيم البروتيني غير محددة مقايسة وإجراءات موحدة لتحديد نشاط البروتياز ، وهو ما نقوم به خلال إجراءات مراقبة الجودة لدينا. في هذا الاختبار ، الكازين بمثابة الركيزة. عندما البروتيني نحن اختبار الكازين هضم ، والأحماض الأمينية التيروسين يتحرر جنبا إلى جنب مع غيرها من الأحماض الأمينية وشظايا الببتيد. كاشف فولين وCiocalteus الفينول ، أو في المقام الأول فولين يتفاعل مع التيروزين مجانا لإنتاج حامل اللون الأزرق اللون ، الذي هو قياس الكمي وكقيمة الامتصاصية على معمل. أكثر التيروزين التي يتم تحريرها من الكازين ، وأكثر يتم إنشاء chromophores وأقوى من نشاط الأنزيم البروتيني. تتم مقارنة القيم الامتصاصية التي تم إنشاؤها بواسطة نشاط الأنزيم البروتيني إلى منحنى القياسية ، التي تم إنشاؤها بواسطة تفاعل كميات معروفة من التيروزين مع كاشف FC لربط التغيرات في الامتصاصية مع مبلغ من التيروزين في micromoles. ويمكن من المنحنى القياسي يحدد نشاط الأنزيم البروتيني عينات من حيث الوحدات ، وهو المبلغ الذي micromoles في المعادلة التيروزين أفرج عنه من الكازين في الدقيقة الواحدة. لعرض هذه المادة باللغة الصينية ، <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">انقر هنا</a>

البروتياز كسر سندات ببتيد. في المختبر ، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لقياس و / أو مقارنة نشاط البروتياز. ويمكن استخدام سيجما نشاط الأنزيم البروتيني غير محددة مقايسة وإجراءات موحدة لتحديد نشاط البروتياز.

تعمل البروتيازات على تكسير الروابط الببتيدية. وغالباً ما يكون من الضروري في المختبر قياس نشاط البروتيازات و/أو مقارنته. إن البروتياز غير النوعي من شركة Sigma...

تعمل البروتيازات على تكسير الروابط الببتيدية في المختبر. وغالباً ما يكون من الضروري قياس أو مقارنة نشاط البروتيازات. ويمكن استخدام مقايسة نشاط البروتياز الشاملة من شركة Sigma كإجراء معياري لتحديد نشاط البروتيازات، وهو ما نقوم به خلال إجراءات مراقبة الجودة لدينا.في هذا المقايسة، يعمل الكازين كركيزة عندما يقوم البروتياز الذي نختبره بهضم الكازين. ويؤدي ذلك إلى تحرير الحمض الأميني تيروزين إلى جانب أحماض أمينية أخرى وشظايا ببتيدية. يتفاعل التيروزين الحر بعد ذلك مع كاشف فولر وكالسيوم فينول أو كاشف فولر لإنتاج كروموفور أزرق اللون، وهو أمر قابل للقياس الكمي ويُقاس كقيمة امتصاص على جهاز المطياف الضوئي.كلما زادت كمية التيروزين المتحررة من الكازين، زاد توليد حاملات الألوان وزاد نشاط البروتياز. وتتم مقارنة قيم الامتصاص الناتجة عن نشاط البروتياز بمنحنى قياسي يتم إنشاؤه عن طريق تفاعل كميات معروفة من التيروزين مع كاشف FC لربط التغيرات في الامتصاص. وبناءً على كمية التيروزين بالميكرومول المستخلصة من المنحنى القياسي، يمكن تحديد نشاط عينات البروتياز من حيث الوحدات، والتي تمثل كمية الميكرومولات من مكافئ التيروزين المتحررة من الكازين في الدقيقة. مرحباً، اسمي كاري كوب فينيارد، وأنا عالمة في منشأة سيجما ألدريتش ديكالب هنا في سانت لويس، ميزوري.سأوضح لكم اليوم طريقة قابلة للتطبيق عالمياً لاختبار نشاط البروتياز في Sigma Aldridge. نستخدم هذا المقايسة بشكل أساسي في قسم مراقبة الجودة لدينا للتأكد من أن البروتياز يتمتع بنشاط كافٍ قبل شحنه مباشرة إلى مختبراتكم. وقبل البدء في المقايسة، نحتاج إلى التأكد من تحضير الكواشف التالية بشكل صحيح.محلول منظم من فوسفات البوتاسيوم بتركيز 50 millimolar، وpH 7.5. يتم وضع المحلول عند درجة حرارة 37 degrees Celsius قبل الاستخدام، ومحلول kasian بتركيز 0.65% وزن/حجم تم تحضيره بخلط 6.5 milligrams إلى milliliters في لتر واحد. يتم رفع درجة حرارة المحلول تدريجيًا مع التحريك اللطيف لتصل إلى 80 إلى 85 degrees Celsius لمدة 10 minutes تقريبًا حتى يتم الحصول على تشتت متجانس.من المهم جداً عدم غلي المحلول. بعد ذلك، يتم ضبط الـ pH إذا لزم الأمر باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. محلول حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك بتركيز 110 millimolar يتم تحضيره عن طريق تخفيف مخزون بتركيز 6.1 normal بنسبة 1 إلى 55 باستخدام ماء منقى، و0.5 millimolar من كاشف fallen and seal calts أو fallen phenol، وهو المحلول الذي سيتفاعل مع التيروزين لإحداث تغيير لوني يمكن قياسه.سيكون ذلك مرتبطاً بشكل مباشر بنشاط البروتياز. يتم تحضير محلول كربونات الصوديوم بتركيز 500 millimolar باستخدام 53 mg/mL من كربونات الصوديوم اللامائية في ماء منقى، ومحلول مخفف للإنزيم يتكون من محلول منظم من خلات الصوديوم بتركيز 10 millimolar مع 5 millimolar كالسيوم عند pH 7.5 ودرجة حرارة 37 °C. هذا المحلول هو ما نستخدمه لإذابة عينات البروتياز الصلبة أو تخفيف محاليل الإنزيمات.يتم تحضير المحلول المخزون القياسي لـ L tyrosine، والذي يجب أن يكون بتركيز أولي قدره 1.1 millimolar، وهو عبارة عن محلول L tyrosine بتركيز 0.2 milligram إلى milliliter، في ماء منقى ويُسخن بلطف حتى يذوب الـ tyrosine. وكما هو الحال مع الـ casein، يجب عدم غلي هذا المحلول. يُترك المحلول القياسي لـ L tyrosine ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة.سيتم تخفيف هذا المحلول بشكل أكبر لإعداد منحنى القياس الخاص بنا إذا لزم الأمر، وذلك باستخدام عينة بروتياز صلبة ذات نشاط محدد مسبقاً، تذاب باستخدام مخفف الإنزيم لتصل إلى 0.1 إلى 0.2 وحدة لكل ملليلتر. يعمل هذا المحلول كضابط موجب لاختبار مراقبة الجودة، وكتحقق من الحسابات التي سنجريها لتحديد نشاط الإنزيم. والآن بعد أن قمنا بتحضير الكواشف وأصبحت جميعها في درجة الحرارة الصحيحة، سنبدأ في اختبار البروتياز.لبدء هذا المقايسة، ابحث عن قوارير مناسبة تتسع لحوالي 15 milliliters. ستحتاج إلى أربع قوارير لكل إنزيم ستقوم باختباره؛ حيث ستُستخدم قارورة واحدة كعينة فارغة (blank)، بينما تُستخدم القوارير الثلاث الأخرى لمقايسة نشاط ثلاثة.تعتبر تخفيفات البروتياز الثلاثة مفيدة عند مراجعة حساباتنا النهائية ومقارنتها ببعضها البعض؛ لذا أضف 5 mL من محلول الكازين بتركيز 0.65% إلى كل مجموعة مكونة من أربعة أنابيب، واتركها لتصل إلى حالة التوازن في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C لمدة خمس دقائق تقريباً. بعد ذلك، أضف تركيزات متفاوتة من محلول الإنزيم إلى ثلاثة من أنابيب العينات الاختبارية، باستثناء الأنبوب الفارغ (blank). اخلطها عن طريق التدوير، ثم قم بتحضينها عند درجة حرارة 37 °C لمدة 10 دقائق بالضبط.إن نشاط البروتياز وما يترتب عليه من تحرر للتيروسين خلال فترة الحضن هذه هو ما سيتم قياسه ومقارنته بين عينات الاختبار. بعد فترة الحضن التي تستغرق 10 دقائق، أضف خمسة ملليلتر من كاشف TCA إلى كل أنبوب. بعد ذلك، يتم إضافة حجم مناسب من محلول الإنزيم إلى كل أنبوب، بما في ذلك أنبوب العينة الفارغة (blank)، بحيث يكون الحجم النهائي لمحلول الإنزيم في كل أنبوب ملليلتر واحد.يتم إجراء ذلك لأخذ قيمة امتصاص الإنزيم نفسه في الاعتبار. الآن، قم بحضن المحاليل عند 30 °C لمدة 30 دقيقة. خلال فترة الحضن هذه التي تستغرق 30 دقيقة، يمكنك البدء في تحضير تخفيفات تيروزين القياسية، والتي يتم إجراؤها باستخدام ستة من قوارير DR.يمكن لذلك أن يتسع بسهولة لثمانية مليلترات في القوارير الست. تُضاف محاليل التيروزين القياسية بتركيز 1.1 millimolar بالأحجام التالية بالمليلتر: 0.05، و0.1، و0.2، و0.4، و0.5. لا تضف أي تيروزين قياسي إلى العينة الفارغة (blank).قد تكون هناك حاجة إلى معايير أقل تركيزاً لعينات اختبار IPU التي ستؤدي إلى تغير طفيف في اللون. وبمجرد إضافة محلول تيروزين القياسي، أضف حجماً مناسباً من الماء المُنقى إلى كل من المعايير ليصل الحجم إلى 2 mL. وبعد فترة الحضانة، قم بترشيح كل من محلول الاختبارات والمحلول الخالي (blank).باستخدام مرشح حقنة بمسامية 0.45 ميكرون، يتم إضافة مليليترين من عينات الاختبار والراشح الفارغ إلى أربعة من قوارير DR التي تتسع لثمانية مليليترات على الأقل. يمكنك استخدام نفس نوع القوارير التي حُضّرت فيها المحاليل القياسية لجميع القوارير التي تحتوي على المعايير والفراغ القياسي، حيث يتم إضافة خمسة مليليترات من كربونات الصوديوم، وللحصول على أفضل النتائج، يُضاف الكاشف المذكور فوراً بعد ذلك. ثم تُضاف كربونات الصوديوم إلى عينات الاختبار والفراغ الخاص بالاختبار. ستلاحظ أن هذه المحاليل تصبح عكرة بعد إضافة كربونات الصوديوم.بعد ذلك، يتم إضافة الكاشف المترسب، والذي سيتفاعل مع التيروزين الحر. ثم تُخلط قوارير DRAM عن طريق التدوير وتُحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بعد هذه الحضنة. يجب أن تلاحظ أن المعايير تظهر تدرجاً في اللون يتناسب مع كمية التيروزين المضافة، حيث تظهر أعلى تركيزات التيروزين باللون الأكثر دكنة.يمكنكم أيضاً ملاحظة تغير ملموس في اللون في عينات الاختبار الخاصة بنا. يتم ترشيح 2 mL من هذه المحاليل باستخدام مرشح حقنة بمسامية 0.45 micron وكوفيت مناسبة. والآن بعد أن انتهينا من المقايسة، لننتقل إلى جهاز المطياف الضوئي ونسجل قيم الامتصاصية.يتم قياس الامتصاصية لعيناتنا بواسطة مقياس الطيف الضوئي باستخدام طول موجي قدره 660 nanometers. يتم ضبط مسار الضوء على واحد centimeter، ثم تُسجل قيم الامتصاصية للمحاليل القياسية، والعينة الضابطة (blank)، وعينات الاختبار المختلفة، وعينة الاختبار الضابطة. وبمجرد جمع كافة البيانات، نصبح مستعدين لإنشاء المنحنى القياسي.من أجل إنشاء المنحنى، يجب حساب الفرق في الامتصاصية بين المحلول القياسي والمحلول الخالي من المادة القياسية (standard blank). تمثل هذه القيمة امتصاصية التيروزين الموجود في المحاليل القياسية. وبعد إجراء هذه الحسبة البسيطة، نقوم بإنشاء المنحنى القياسي عن طريق رسم التغير في الامتصاصية للمحاليل القياسية على محور Y مقابل الكمية بالميكرومول لكل من المحاليل القياسية الخمسة على محور x.بمجرد إدخال نقاط البيانات الخاصة بنا وإنشاء خط الملاءمة الأفضل، نحدد التغير في الامتصاصية في عينات الاختبار من خلال حساب الفرق بين امتصاصية عينة الاختبار وامتصاصية العينة الفارغة (blank) الخاصة بها. وبالنظر إلى المنحنى القياسي، نحدد قيمة الامتصاصية لإحدى عينات الاختبار على محور Y. ثم نتحرك بشكل موازٍ لمحور X، حيث نرسم خطاً ونتوقف عند النقطة التي يتقاطع فيها مع المنحنى القياسي.بعد ذلك، ومن إحداثي X المأخوذ عند هذه النقطة، نحصل على كمية وميكرومولات التيروزين المتحررة خلال هذا التفاعل البروتيني المحدد. ولحساب نشاط الإنزيم بوحدات لكل مليلتر، قم بإجراء العملية الحسابية التالية: خذ عدد مكافئات ميكرومولات التيروزين المتحررة، والتي تم الحصول عليها من المنحنى القياسي، واضربه في الحجم الكلي للمقايسة بالمليلتر، وهو في حالتنا هذه 11 milliliters. ثم اقسم هذه القيمة على ثلاث كميات أخرى.وقت المقايسة، والتي أجريناها لمدة 10 minutes، وحجم الإنزيم المستخدم في المقايسة، والذي تم تغييره؛ لنستخدم 1 mL. أما حجم الـ milliliters المستخدم في الكشف اللوني، فقد يختلف بناءً على جهاز Q vet الخاص بك.نستخدم مليلترين. وبقسمة ميكرومولات التيروزين على الزمن بالدقائق، نحصل على قياس لنشاط البروتياز نطلق عليه اسم الوحدات. ويمكننا شطب وحدات قياس الحجم في البسط والمقام، وبالتالي يتبقى لدينا قياس لنشاط الإنزيم بدلالة الوحدات لكل مليلتر.من أجل تحديد النشاط في عينة بروتياز صلبة مُخففة في مُخفف الإنزيم، نقوم بقسمة النشاط بوحدة units per milliliter على تركيز المادة الصلبة المستخدمة في هذا المقايسة أصلاً بوحدة mg/mL، مما يعطينا النشاط بوحدة units per milligram. لقد استعرضنا للتو كيفية تحليل نشاط البروتياز باستخدام مقايسة نشاط البروتياز العامة من شركة Sigma. وكما رأيتم عند تنفيذ هذا الإجراء، فمن الضروري جداً تذكر تسخين كل من محاليل الكازين والتيروزين ببطء وعدم تركها تصل إلى درجة الغليان.علاوة على ذلك، من الضروري تحضير عينات ضابطة (blanks) مختلفة لكل من المحاليل القياسية ولكل عينة اختبار لديك. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في قياس أنشطة البروتياز.

sigma-s-non-specific-protease-activity-assay-casein-as-a-substrate

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

تم تصميم مجموعة أدوات الكشف عن البروتياز نيون لقياس نشاط الأنزيم البروتيني باستخدام قياس التألق. بل هو أيضا مناسبة للكشف عن كميات ضئيلة من التلوث البروتيني. يستند هذا الأسلوب على hydroysis بروتين من صيغة الملكية للركيزة الكازين FITC المسمى.

استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني

نحن نطبق التسمية خالية من تحليل التفاعل البروتين باستخدام X100 Biacore للهيكل وظيفة تحليل الربط العديد من المسوخ B cystatin إلى غراء من خلال توصيف الحركية. المعايرة خالية من التحليل تركيز (CFCA) يقيس تركيز البروتين مع النشاط ملزم الاحتفاظ دون الحاجة إلى منحنى القياسية. نظهر أن تأكيد باستخدام تركيزات CFCA يزيد من مصداقية هذا التحليل الحركي ويمكن أن يعتمد عليه أن يحدد الثوابت الحركية حتى إذا تم خفض نشاط بروتين المؤتلف.

على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

يوضح هذا الفيديو مقايسة مستشعر حيوي موصلية لدراسة تفاعل الجسم المضاد مع مستضد مستهدف ثابت على شريحة محول الطاقة. تم تصميم المستشعر الحيوي ليحتوي على بروتين خيميري ثنائي الوظيفة - إنزيم β لاكتاماز مع موقع تحفيزي وظيفي مدمج في جسم نانوي للارتباط بالمستضد المستهدف الثابت للحركة. عند الارتباط ، يولد التحلل المائي التحفيزي لركيزة المضادات الحيوية بواسطة إنزيم β-lactamase إشارة كهربائية - مما يؤكد تفاعل المستضد والأجسام المضادة.

مقايسة المستشعر الحيوي الموصلية القائمة على β-اللاكتاماز لتفاعلات البروتين والبروتين

يوضح هذا الفيديو فحصا لفحص النشاط المحلل للبروتياز للبروتياز باستخدام الببتيدات الفلورية. يتعرف البروتياز على موقع الانقسام الخاص به على الببتيد ، ويشقه ويفصل المروي عن الفلوروفور ، مما يتيح انبعاثه الفلوري. يتم الكشف عن إشارة التألق وتحليلها للتحقق من كفاءة الانقسام لمتغيرات الببتيد المختلفة.

مقايسة انقسام الببتيد الفلوروجينيك لفحص النشاط المحلل للبروتياز

يوضح هذا الفيديو كيفية قياس نشاط البروتيازوم في مقصورات فرعية مختلفة من اللوزة الجانبية من أدمغة الفئران المكيفة بالخوف والتحكم فيها باستخدام مقايسة الببتيد الفلوري. يشق البروتيازوم ركيزة الببتيد الفلوروجينيك ، ويطلق جزيئات الفلورسنت ، والتي يتم قياسها كميا باستخدام قارئ الألواح لتقييم نشاط البروتيازوم في كسور البروتين النووي والمشبكي. يشير النشاط النووي المتزايد إلى تغييرات في التعبير الجيني ، بينما يشير انخفاض النشاط المشبكي إلى استقرار البروتين الضروري للحفاظ على الذاكرة على المدى الطويل.

قياس نشاط البروتيازوم في مقصورات مختلفة تحت الخلايا في دماغ الفئران

هنا ، نقدم بروتوكولات لفحص وتوصيف الإنزيمات بسرعة للنشاط المضاد للميكروبات. يستخدم مقايسة انتشار الشرائح الدقيقة ومقايسة إطلاق الصبغة ركائز بكتيرية مستهدفة لتقييم النشاط الأنزيمي النوعي والكمي.

فحوصات النوعية والكمية للكشف وتوصيف مضادات الميكروبات البروتين

هنا، نقدم بروتوكول لتحديد خصوصية حوزتي في النسيج الخام الماوس مقتطفات استخدام TOF استخدام قياس الطيف الكتلي.

مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

ونقدم مقايسة انقسام ببتيد فلوروجينيك التي تسمح فرز سريع لنشاط البروتياز proteolytic على الببتيدات يمثل موقع الانقسام الببتيدات الانصهار الفيروسية. يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوب على أي فكرة من الأحماض الأمينية الأخرى ضمن تسلسل بروتين لاختبار النشاط حوزتي.

"مقايسة الانقسام الببتيد فلوروجينيك" على الشاشة "النشاط بروتيوليتيك": تطبيقات للفيروس التاجي المسبّب لارتفاع البروتين التنشيط

نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتقنية زيموجرافيك معدلة التي تستخدم الببتيدات فلوري كالركيزة القابلة للتحلل بدلاً من البروتينات الأصلية. التفريد العينات البيولوجية في الببتيد نيون زيموجرامس تمكن من كشف طائفة أوسع من البروتياز تقنيات زيموجرافيك السابقة.

الكشف عن نشاط البروتياز الببتيد نيون زيموجرافي

في هذه المخطوطة، قمنا بإنشاء أسلوب عالية إنتاجية تحديد مقدار النشاط الفوسفاتيز القلوية في المذهبة س. بيوفيلم الثقافة من لوحة زراعة الأنسجة...

قياس الألوان "التحليل من القلوية الفوسفاتيز النشاط" في المذهبة س. بيوفيلم

تصف هذه الطريقة مقايسة الترسيب في المختبر القائمة على الليكتين لتحديد تقارب الارتباط بين فوسفاتيز الجلوكان والأميلوبكتين. يمكن الاعتماد على اختبار الترسيب المشترك هذا لقياس ارتباط ركيزة الجلوكان الفوسفاتيز ويمكن تطبيقه على ركائز الجلوكان المختلفة القابلة للذوبان.

مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان

تعلم قياس نشاط البروتياز باستخدام الكازين كركيزة وتحرير التيروزين كمؤشر. تُستخدم هذه الطريقة الموحدة للتحكم في الجودة المخبرية وضمان فعالية إنزيمات البروتياز.

سيجما للنشاط غير محددة البروتياز الفحص -- باعتباره الركيزة الكازين

استكشف المزيد من الفيديوهات