في المختبر عن طريق الجمعية النووية مجزأ مقتطفات البيض القيطم

تعد مستخلصات بيض Xenopus laevis مفيدة كمواد سيتوبلازمية وعضيات لإعادة تكوين الأحداث الخلوية في المختبر، مثل التجميع النووي واستيراد البروتينات النووية. فعندما يُضاف DNA الكروماتين المنوي إلى مستخلصات بيض XUS، سواء كانت خاماً أو مجزأة، ترتبط الحويصلات الغشائية الموجودة في المستخلص بسطح الكروماتين وتندمج، ثم تدمج مكونات المسام النووية لتكوين نوى اصطناعية وظيفية بالكامل. ويصبح بعد ذلك من الممكن توصيف الأساس الجزيئي لهذه العمليات عن طريق الاستنفاد المناعي للمستخلصات وعن طريق تحرير البروتين.

مرحباً، اسمي ماري كروس وأنا طالبة دراسات عليا في مختبر الدكتورة مورين باور في قسم بيولوجيا الخلية بجامعة إيموري في أتلانتا، جورجيا. سنوضح لكم اليوم كيفية تكوين النوى في المختبر باستخدام مستخلصات بيض الزينوبكس المجزأة. تتضمن هذه العملية الخطوات التالية: إجراء تفاعل تجميع النواة وتقييم تكوين النوى.

لنبدأ الآن. لبدء عملية التجميع النووي، خذ جزءاً من السيتوسول المجزأ وأضف الفوسفوكرياتين من محلول مخزن بتركيز 0.2 molar ليصل التركيز النهائي إلى 20 millimolar. ثم أضف كرياتين كيناز من محلول مخزن بتركيز خمسة milligram per milliliter ليصل التركيز النهائي إلى 50 micrograms per mil.

أخيراً، أضف 20 µM من A TP باستخدام محلول مخزون بتركيز 0.2 M. بعد ذلك، أضف الأغشية الخفيفة إلى العصارة الخلوية بتخفيف بنسبة 1 إلى 10. وهذا يقرب كمية الغشاء الموجودة في المستخلص الخام الأصلي.

امزج جميع المكونات عن طريق السحب والضخ بالمصّة لتوزيع الأغشية في المستخلص. يجب القيام بهذه الخطوة قبل إضافة كروماتين الحيوانات المنوية. بعد ذلك، أضف كروماتين الحيوانات المنوية إلى المستخلص المجزأ بالتركيز المطلوب، وامزج المستخلص والحيوانات المنوية معاً على الفور عن طريق السحب والضخ اللطيف بالمصّة باستخدام طرف مقطوع.

عندما يُضاف كروماتين الحيوانات المنوية إلى المستخلص، يبدأ على الفور في فك التكثيف، ثم يتكثف مجدداً، ويصبح عرضة للقص. وبشكل عام، يتم إعداد هذه التفاعلات في أنابيب طرد مركزي سعة 500 µL بحجم إجمالي يقل عن 100 µL. وتدعم مستخلصات البويضات تكوين ما يصل إلى 8,000 إلى 9,000.

نوى لكل ميكرولتر، تُحضن المادة المخلوطة لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين في درجة حرارة الغرفة للسماح بتكوّن النوى. يتم تصوير النوى باستخدام الصبغ. وبعد مرور 30 دقيقة تقريباً، ستظهر النوى المتكونة حديثاً صغيرة الحجم وبيضوية الشكل.

لا يزال الحمض النووي DNA مكثفاً للغاية، ويجب أن تظهر النواة بلون أزرق فاتح صلب نتيجة لـ hook spining عند رصدها في القناة فوق البنفسجية UV مع تكثف الـ DNA. علاوة على ذلك، سيكون الصبغ الأزرق أقل تجانساً مع ظهور فجوات سوداء في نهاية المطاف. يمكن تصور تشكل الغشاء النووي عن طريق إضافة 1 µg لكل ذكر من three three diaa carbox amine أو DHCC إلى المثبت.

يُعد DHCC صبغة محبة للدهون فلورية يتم رصدها في قناة الفلورسئين. في المراحل المبكرة من تجميع النوى، ترتبط الحويصلات الغشائية بسطح الكروماتين وتبدأ في الاندماج على شكل رقع. يؤدي ذلك إلى ظهور غير منتظم ومتقطع للغشاء الآخذ في التكون.

بمجرد اكتمال الغشاء، فإنه يتسطح فوق السطح النووي وسيظهر كحافة مستوية وغير منقطعة حول DNA. سيكون هناك قدر كبير من الفلورية الخلفية في السيتوسول المحيط بسبب حويصلات الغشاء التي لم تندمج في النوى. لقد عرضنا لكم للتو إعادة تكوين النواة في المختبر (in vitro) باستخدام أجزاء غشائية ذائبة وخفيفة من مستخلص بيض Xenopus.

من المهم تذكر أنه يمكن استخدام المستخلص الخام للتجميع النووي، ولكن ليس بعد عملية التجميد والإذابة. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.