باستخدام الملقط ليزر لمعالجة الخلايا العصبية معزولة في المختبر

كان أشكين أول من أثبت أن الملاقط الليزرية أو المصائد البصرية تمثل أداة قوية للتحكم في الأجسام الحية المجهرية الدقيقة. سنعرض في هذا الفيديو كيف طبقنا هذه التقنية لالتقاط العصبونات وتحريكها. هذه هي محطة عمل الملاقط البصرية.

توضح الأسهم الخضراء المسار الذي يسلكه شعاع الليزر عبر بصريات المجهر. فعندما ينكسر شعاع الليزر، الذي تم تركيزه بواسطة عدسة المجهر الشيئية، بواسطة خلية ما، فإن القوة التي تغير اتجاه شعاع الضوء تؤثر على الخلية، مما يحركها باتجاه مركز التركيز.

يولّد هذا قوة بمقدار بيكا نيوتن تكفي لسحب خلية عبر الوسط. سنتحدث في هذا الفيديو عن تصنيع الأطباق، وتحضير خلايا الشبكية، وزراعة الخلايا في أطباق الزرع، والتحكم باستخدام الملاقط الليزرية، ومراقبة نمو الخلايا. ونظراً لأن الخلايا تلتصق بالزجاج، فقد احتجنا إلى إنشاء منطقة طاردة للخلايا حيث يمكن احتجاز الخلايا بسهولة باستخدام الملاقط.

تم طلاء نصف الطبق بـ poly hema، وهو بوليمر طارد للخلايا. بينما طُلي النصف الآخر بـ cell one، وهي مادة ركيزة تدعم نمو خلايانا. أولاً، يتم تحديد خلية في الجانب اللاصق للخلايا من الطبق.

يتم بعد ذلك احتجاز خلية أخرى على جانب البوليمر ونقلها إلى الجانب اللاصق حيث يتم زاوج الخليتين. ولتجهيز الأطباق، نستخدم أطباق زراعة من نوع polystar معقمة ومزالة الغبار بقطعة قماش، بقطر 35 مليمتر. أولاً، نقوم بعمل ثقب بقطر 1 سنتيمتر في القاع باستخدام مخرطة صغيرة أو مثقاب كهربائي.

أحضر شرائح غطاء زجاجية نظيفة بالحمض وضعها بشكل عمودي في بيئة خالية من الغبار مثل غطاء التدفق الصفائحي (hood). خذ محلول polyus المذاب في كحول بتركيز 95% وضع بضع قطرات بالقرب من الجزء العلوي من شريحة الغطاء على نصف واحد فقط. اترك poly hema ليجف. ثم قم بتمييز الجانب الذي يحتوي على polyus من شريحة الغطاء.

ضع واقي S حول الفتحة الموجودة في قاع طبق المزرعة. قم بلصق غطاء الزجاج بالطبق باستخدام واقي S. تأكد من أن البولي أميد في الداخل، وتأكد أيضاً من عدم وجود تسريبات من خلال الفجوات في واقي العتبة.

ضع غطاء الشريحة بحيث يمتد طرف طلاء poly hema على طول مركز الطبق. اترك الطبق ليجف لمدة يومين إلى ثلاثة أيام، ثم قم بخدش قاع الطبق باستخدام قلم ذو سن ماسي لعمل علامات، والتي ستعمل كنقاط مرجعية لتحديد موضع الطبق على منصة المجهر. ضع الأطباق في خزانة التدفق الصفحيي وعقمها باستخدام الأشعة فوق البنفسجية.

ضع قطرة أو قطرتين من محلول أجسام مضادة من الماعز ضد US على الجانب غير المغطى بـ polyus في الطبق، مع الحرص على عدم سكبها على الطلاء نصف الدموي poly، واتركها لمدة ثلاث ساعات تقريباً. قم بإزالتها واغسلها بمحلول رينجر المعقم. ضع محلول الجسم المضاد للخلية الأولى على المنطقة نفسها واتركها في الحاضنة طوال الليل لتكون جاهزة للتجربة في اليوم التالي.

تُشتق الخلايا في مختبرنا من شبكيات السلمندر البالغ في طوره المائي. يتم تشريح الشبكيات وإزالتها، ثم هضمها باستخدام إنزيم. بعد ذلك، يمكن زراعة الخلايا المعزولة في أطباق الزرع.

يتم استئصال العينين. ثم تُشرح القرنية وتُزال. يُوضع تجويف العين في محلول رينجر المعقم.

يتم فصل الشبكية عن كأس العين عن طريق استخراجها باستخدام حافة ملقط منحني. يتم ضخ ثاني أكسيد الكربون والأكسجين في محلول رينجر يحتوي على البروبان، ثم يتم التعقيم من خلال مرشح دقيق للغاية بسعة 0.2 ميكرون. توضع الشبكات في محلول الإنزيم وتُهضم لمدة 40 دقيقة تقريباً مع التقليب لتفكيك الأنسجة.

بعد الغسيل ثلاث مرات، يتم تفكيك الشبكيات بواسطة tri. وباستخدام ماصة ذات رأس كروي بقطر ثلاثة مليمترات، تصبح الخلايا المعزولة جاهزة للزراعة قبل البدء بعملية الزراعة. يوضع طبق المزرعة الذي يحتوي على الوسط على منصة المجهر ويتم توجيهه بشكل مناسب باستخدام علامات الخدش الموجودة في قاع الطبق.

يسمح ذلك بتكرار الموضع الدقيق للطبق في وقت لاحق. ثم يتم زرع الخلايا على كلا جانبي الطبق، الجانب المغطى بـ poly hema والجانب المخصص للخلايا. ويتم التحكم في موضع الطبق على منصة المجهر، وكذلك في قدرة الليزر، باستخدام عصا التحكم.

أولاً، قمنا بتحديد خلية ملتصقة بأحد جوانب الطبق. هذه خلية شبكية متعددة الأقطاب يمكن التعرف عليها من خلال زوائدها الشجيرية. يتم حفظ إحداثيات موقع الخلية.

هذه خلية مستقبلات ضوئية عصوية تقع على الجانب الطارد للخلايا من مادة polyus في الطبق. يتم خفض الطبق، ثم يتم التقاط الخلية بواسطة الليزر ورفعها بعيداً عن قاع الطبق. يتم الآن نقل الخلية إلى الجانب الآخر من الطبق وصولاً إلى إحداثيات الخلية متعددة الأقطاب.

في الواقع، تكون الخلية ثابتة، بينما يتحرك الطبق. تمر الخلية الآن فوق حافة طلاء poly hemo.

البروز الممتد من الخلية هو النهاية المحورية. تظهر الخلية بعيدة تماماً عن أي حطام أو خلايا أخرى في قاع الطبق، والتي قد تعيق حركتها. وتظهر صور الخلايا الموجودة في قاع الطبق خارج نطاق التركيز في الخلفية.

تصل خلية العصوية إلى الخلية متعددة الأقطاب، ويمكن وضعها بدقة عند النقطة والمسافة المطلوبتين من تلك الخلية. يتم رفع الطبق وتلتصق الخلية بالركيزة الخلوية. وتتمثل المزايا الأساسية لهذا الإجراء في إمكانية اختيار الخلايا المراد نقلها، وإمكانية إجراء هذه العمليات ضمن تجربة معقمة ومغلقة.

يمكن مراقبة التفاعلات بين الخلايا باستخدام التصوير الزمني للفيديو أو التصوير الفوتوغرافي الرقمي. ويمكن استخدام الملاقط الليزرية مع أي تقنية بيولوجية؛ حيث توضح هنا، على سبيل المثال، تقنية الفلورسنس وجود البروتينات المشبكية عند نقاط الاتصال بين الخلايا التي يتم تحريكها بواسطة الملاقط.