Name: دراسة النشوء الأحيائي الأغشية مع الفحص الجيني مراسل Luciferase المستندة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-09-07T14:36:00.000+00:00
Duration: 13 min 48 s
Description: اكتشف كيفية دراسة التعبير الجيني المستحث بالبلعمة باستخدام تقنية Luciferase المستندة. يوضح هذا البروتوكول تحليل تنظيم الجينات المشاركة في تكوين الأغشية الخلوية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

خلية ثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزرع الثقافات المخزون الكلى الجنينية البشرية 293 (HEK293) خلايا في 10 سم ، والأطباق الثقافة في &quot;وسيط&quot; ، ويتألف من متوسطة Dulbecco في التعديل النسر (DMEM) تستكمل مع مزيج من المضادات الحيوية (100 وحدة لكل مل من البنسلين وميكروغرام 100 لكل مل من كبريتات ستربتومايسين) و 10 ٪ مصل بقري جنيني (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنشاء خلايا للتجربة ، وامتص المتوسط ​​قبالة ، ويتم غسل الخلايا مرتين مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) حل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم تتم إزالة برنامج تلفزيوني واستبدالها 0.6 مل من محلول يحتوي على 0.25 ٪ التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وحضنت الطبق في 37 ˚ مئوية لمدة حوالي 2 دقيقة حتى الخلايا بدأت فصلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5.5 مل من المتوسط ​​هو إضافة إلى تحييد التربسين ويتم عد الخلايا مع عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتضعف الخلايا إلى 320000 خلية لكل مل والاستغناء عند 0.1 مل لكل بئر في المغلفة متعدد الليزين 96 - جيدا لوحة الثقافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الطبق في منديل حاضنة الثقافة في 37 ˚ C مع جو CO2 تحتوي على 8.8 ٪ وتنمو لمدة 24 ساعة. </li></ol> Transfections <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التحضير للtransfections ، ينبغي النظر فيه كم هي متماثلة التي يتعين القيام بها في الظروف التجريبية وما مبالغ البلازميد سوف تكون transfected. نقوم بشكل روتيني في جميع الظروف وثلاث نسخ transfect مجموعه من 50 إلى 100 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد لكل بئر. وينبغي أن يمزج البلازميد على الأقل مراسل بناء معربا عن يراعة luciferase والتحكم البلازميد luciferase Renilla من التعبير عن مروج التأسيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وpipetted حلول البلازميد في أنابيب microcentrifuge 1.5 مل وتستكمل مع 10 ميكرولتر لكل عينة من المصل DMEM حرة وخالية من المضادات الحيوية. على سبيل المثال ، إذا كان 20 بئرا لتكون هي كل transfected 50 ميكروغرام مع الحمض النووي ، إضافة إلى 200 DMEM ميكروليتر DNA ميكروغرام 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى الحل DMEM / إضافة 3 ميكروليتر DNA &quot;العابر 293 كاشف&quot; (Mirus) في الحمض النووي ميكروغرام. مزيج من قبل pipetting ارتفاعا وانخفاضا ، والسماح للعينات تقف في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال هذه الفترة ، وإزالة وسائل الإعلام من 96 لوحة والثقافة ، وكذلك استبدال 90 ألف ميكرولتر من متوسطة جديدة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى كل جانب 10 ميكرولتر من الخليط DMEM 293 / DNA / العبور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الطبق في منديل حاضنة الثقافة في 37 ˚ C مع جو CO2 تحتوي على 8.8 ٪ وتنمو لمدة 24 ساعة. </li></ol> البلعمة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المعلقات المحتوية B المتوسطة (خليط من 01:01 DMEM ولحم الخنزير والمتوسطة بالاضافة الى المضادات الحيوية F12 و 10 ٪ FBS) ، بالإضافة إلى 0.75 ميكرون ، الخرز اللاتكس عند مستوى الصفر ، إلى 1 مغ لكل مليلتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من 96 لوحة والثقافة ، وكذلك استبدال بنسبة 0.1 مل من الايقاف في حبة متوسطة B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في لوحة لمدة 2 دقيقة في 1000 × ز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم يتم استزراع خلايا في 37 ˚ مئوية لمدة 6-16 ساعات. تبعا للظروف والمروج المستخدمة في محرك الأقراص يمكن الكشف luciferase ، مراسل الجين زادت التعبير بعد 1-3 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في نفس الحالات قد يكون من الضروري لاحتضان الخلايا مع حبات لمدة 30 إلى 60 دقيقة ، ثم نفذ 2 يغسل مع برنامج تلفزيوني لإزالة الخرزات الفردية ، وإضافة جديدة وسائل الاعلام قبل تفرخ الخلايا لفترات إضافية من الزمن. </li></ol> الفحص المزدوج GloTM Luciferase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملاحظة : لدينا بروتوكول لاستخدام هذه المجموعة يختلف في بعض النواحي من تلك الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. وقد تم تعديل ذلك لتقليل كمية من الكواشف المطلوبة لكل عينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل DTT M 1 ، تقسيمها إلى aliquots صغيرة متعددة وتخزينها في -20 جيم ˚ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعد منطقة عازلة تحلل تحتوي على 20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك (7.8 درجة الحموضة) ، و 10 ٪ (V / V) الجلسرين ، و 0.5 ٪ (V / V) تريتون X - 100. قبل الاستخدام ، قسامة مبلغ اللازمة للتجربة وإضافة 1 مل من ميكرولتر في DTT M 1 زائد البروتياز كوكتيل مثبط للتركيز النهائي من 0.5 إلى 1X. لا إعادة استخدام الحل DTT متبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند استخدام طقم ثنائي GloTM للمرة الأولى ، إعداد الكاشف (اليراع) Luciferase بنقل محتويات زجاجة واحدة من الاحتياطي Luciferase المزدوجة GloTM (بشرط مع عدة) لزجاجة واحدة من الركيزة Luciferase المزدوجة GloTM (شريطة مع عدة). تقسيم الكاشف Luciferase غير المستخدمة إلى 10 ميلي aliquots وتخزينها في -20 جيم ˚ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة 96 - جيدا من نسيج الثقافة الحاضنة ووضعه على الجليد. إزالة وسائل الاعلام والطموح ، إضافة 40 ميكرولتر لكل بئر من تحلل العازلة ، ثم يترك لوحة على الجليد لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في كامد ، أبيض 96 - جيدا لوحة (OptiplateTM - 96 ، رقم الكتالوج بيركن إلمر 6005290) قسامة 15 ميكرولتر لكل بئر من Luciferase الكاشف ، ثم إضافة 15 ميكرولتر من lysate الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة ثم قراءة التلألؤ في microplate القارئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور قبل استخدامه ، وإعداد مبلغ مناسب من Renilla حل الركيزة luciferase بإضافة جزء 1 المزدوجة وإيقاف GloTM بالشبكة ®؛ الكاشف (بشرط مع عدة) إلى 100 جزء المزدوجة وإيقاف GloTM بالشبكة ® العازلة (بشرط مع عدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى كل جانب 15 ميكرولتر لكل بئر من الحل الركيزة luciferase Renilla ، يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة ثم قياس التألق مرة أخرى. </li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يفصحون عنه.

دراسة النشوء الأحيائي الأغشية مع الفحص الجيني مراسل luciferase المستندة

Studying Membrane Biogenesis with a Luciferase-Based Reporter Gene Assay

لدراسة مسارات مختلفة من التنسيق توليف الدهون أثناء نشوء حيوي غشاء من المفيد للعمل مع نظام تجريبي حيث نشوء حيوي الغشاء يحدث بسرعة وبطريقة محرض. لقد وجدنا أن البلعمة من الخرز اللاتكس هو عملي لهذه الأغراض كخلايا توليف الدهون بسرعة لتجديد الغشاء غشاء برك كما فقدت التفاف المواد خلال الإحاطة الجسيمات. هنا ، نحن تصف إجراءات لدراسة التغيرات في البلعمة التي يسببها التعبير الجيني مع نهج مراسل الجين luciferase المستندة إلى استخدام مزدوج بالشبكة نظام الفحص Luciferase من Promega.

هنا ، نحن تصف إجراءات لدراسة التغيرات في البلعمة التي يسببها التعبير الجيني مع نهج مراسل الجين luciferase المستندة إلى استخدام مزدوج GloTM نظام الفحص Luciferase من Promega.

دراسة النشوء الأحيائي الأغشية مع الفحص الجيني مراسل Luciferase المستندة

لدراسة تنسيق مسارات تخليق الدهون المختلفة أثناء التخليق الحيوي للأغشية، من المفيد العمل باستخدام نظام تجريبي حيث تكون الأغشية...

مرحباً، أنا أدرس تنسيق مسارات تخليق الدهون المختلفة في عمليات التذكر والنشوء الحيوي. ومن المفيد امتلاك نظام تجريبي يحدث فيه النشوء الحيوي للأغشية بشكل سريع وقابل للاستحثاث. وقد وجدنا أن عملية البلعمة لحبيبات اللاتكس مفيدة بشكل خاص لهذه الدراسات، لأن الخلايا تقوم بتخليق أغشية جديدة بسرعة كبيرة لتعويض تلك التي فُقدت كمواد تغليف في المراحل المبكرة من عملية الابتلاع.في هذا الفيديو، سيقوم زميلي Ong Zang باستعراض الإجراءات التي استُخدمت لدراسة التغيرات في التعبير الجيني المستحثة بعملية البلعمة باستخدام نهج تحليل تقريري يعتمد على Luciferase، حيث تقول: مرحبًا، أنا X من مختبر exon North في قسم البيولوجيا الجزيئية والخلوية بجامعة هارفارد. اليوم سأوضح لكم كيفية استخدام تحليل الجين التقريري لتحليل تنظيم الجينات المشاركة في التخليق الحيوي للأغشية بعد عملية البلعمة. فلنبدأ الآن.لهذا الإجراء، نستخدم مستنبتات من خلايا الكلى الجنينية البشرية 2 93. تُنمى هذه الخلايا في أطباق استنبات بقطر 10 سنتيمتر في الوسط A، والذي يتكون من وسط Eagles modified basal medium أو DMEM المكمل بـ 10% fetal B serum أو FBS ومزيج من المضادات الحيوية. وباستخدام تقنية التقييس، يتم فصل الخلايا عن قاع الطبق، ثم عدها، وبعد ذلك تُنشر على أطباق ذات 96 بئراً مطلية بالبولي ليسين حيث تُترك لتنمو لمدة 24 ساعة قبل البدء في عملية التحول.بالنسبة لعملية عفن الخلية (transfection)، نقوم بشكل روتيني بتنفيذ جميع الظروف في ثلاث مكررات، ونستخدم في عملية عفن الخلية إجمالي 50 إلى 100 nanogram من DNA البلازميدي لكل بئر. يجب أن تشمل خلطات البلازميد على الأقل البناء المراسل الذي يعبر عن luciferase اليراعة والبلازميد الضابط الذي يعبر عن renal lucifers من محفز بنيوي. للبدء، قم بتحضير خليط من DMEM الخالي من المصل والمضادات الحيوية مع كاشف عفن الخلية trans 2 N 3؛ استخدم 10 µL من DMEM لكل بئر سيتم إجراء عفن الخلية له، وأضف 3 µL من كاشف trans 2 9 3 لكل microgram من DNA البلازميدي.على سبيل المثال، إذا كان المطلوب إجراء عملية عفن (transfection) لـ 20 بئراً، يتم استخدام 50 nanogram من DNA مع 3 µL من كاشف trans 2 9 3 مضافاً إلى 200 µL من وسط DMEM. يتم خلط المحلول عن طريق سحبه وطره بالماصة بشكل متكرر، ثم يُترك دون تحريك في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق على الأقل. بعد ذلك، يتم نقل DNA إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة. وعادة ما تتراوح تركيزات المحاليل المخزنة لدينا بين 10 و 100 nanogram لكل µL.بمجرد تحضين خليط انتقال DM M لمدة خمس دقائق، يتم نقله إلى أنبوب DNA ويُخلط المحلول مرة أخرى عن طريق السحب والضخ بالماصة. بعد ذلك، تُترك العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. وخلال فترة التحضين التي تستغرق 20 دقيقة، يتم إزالة الوسط من لوحة الزرع ذات الـ 96 بئراً واستبداله بـ 19 microliter من الوسط A الطازج، وبمجرد اكتمال التحضين، يتم نقل 10 microliter من خليط D-M-M-D-N-A إلى كل بئر.يجب سحب الخليط بواسطة الماصة ونقله مباشرة إلى السائل الموجود. تجنب ملامسة طرف الماصة لجدار الأنبوب. ومن المهم أيضاً تضمين ثلاث آبار من الخلايا التي ستترك دون فحص.سيتم لاحقاً طرح متوسط نشاط luciferase في هذه الآبار كخلفية؛ ضع طبق 96 بئراً في الحاضنة عند درجة حرارة 37 °C وقم بتنمية الخلايا لمدة 24 ساعة. بمجرد اكتمال فترة الحضانة التي استغرقت 24 ساعة، نبدأ في تحفيز التخليق الحيوي للغشاء، التخليق الحيوي لـ lax beads. للبدء، قم بتحضير معلق يحتوي على وسط زراعة الخلايا و lax bead.للقيام بذلك، قم بتحضير الوسط B، وهو خليط بنسبة واحد إلى واحد من وسط DMEM ووسط F المضاف إليه المضادات الحيوية و10% FBS. بعد ذلك، أضف حبيبات latex بقطر 0.75 ميكرون بتركيزات تصل إلى 1 mg/mL. وبالطبع، يجب أن تتضمن كل تجربة ضوابط لا يتم فيها إضافة الحبيبات.بعد ذلك، قم بإزالة الوسط من طبق الزرع المكون من 96 بئراً واستبدله في كل بئر بـ 100 µL من معلق الخرز. وبمجرد إضافة المعلق، قم بتدوير الطبق لمدة دقيقتين عند 1000 G. يساعد ذلك في تركيز الخرز في قاع البئر ويسهل عملية البلعمة. بعد ذلك، يتم تحضين الخلايا عند 37 °C لمدة تتراوح من 6 إلى 16 ساعة.اعتماداً على الظروف والمحفز المستخدم لزيادة إنتاج لوسيفيراز، يمكن الكشف عن تعبير الجين المحفز بعد ساعة إلى ثلاث ساعات. وفي بعض التجارب، قد يكون من الضروري فصل fal عن تخليق الدهون، على سبيل المثال، لدراسة آثار عقاقير معينة على تخليق الدهون دون التأثير على تنظيم الجسيمات. وفي مثل هذه الحالات، يتم تحضين الخلايا مع الخرز لمدة تتراوح من 30 إلى 60 دقيقة للسماح للخلايا بابتلاع الخرز.بعد هذه الحضانة، تُغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS لإزالة الخرزات غير المرتبطة. بعد ذلك، يُضاف وسط غذائي جديد وتُحضن الخلايا لمدة تتراوح بين 6 إلى 16 ساعة للتعبير عن الجين المراسل. الآن أصبحنا مستعدين للمضي قدماً في إجراء مقايسات ferous.لبدء مقايسات اللوسيفيراز، قم بتحضير محلول منظم xis يحتوي على 20 مليون مولار من Tris، وHCl بـ pH 7.8، و10% حجم/حجم من الجلسرول، و0.5% حجم/حجم من Triton X-100 قبل الاستخدام، وبالكمية الكافية المطلوبة للتجربة. بعد ذلك، أضف ميكرولتر واحد لكل ملليلتر من DTT بتركيز 1 مولار. لا تقم بإعادة استخدام محلول DTT المتبقي.ثم أضف مزيج مثبطات البروتياز ليصل إلى تركيز نهائي يتراوح بين 0.5 إلى 1 مرة. عند استخدام مجموعة dual glow لأول مرة، يتم تحضير كاشف luciferase لليراعات عن طريق نقل محتويات زجاجة واحدة من dual glow lucifers buffer بالكامل إلى زجاجة واحدة من dual glow luciferase substrate. قسم كاشف luciferase غير المستخدم إلى أنابيب 10 مليمتر وخزنها عند -20 °C. بمجرد تجهيز كاشف luciferase، أخرج طبق 96 بئر من حاضنة المزارع النسيجية وضعه على الثلج. بعد ذلك، قم بإزالة الوسط عن طريق الشفط، ثم أضف 40 µL من محلول التحلل (lysis buffer) لكل بئر واترك الطبق على الثلج لمدة 30 دقيقة.بعد ذلك، يتم إضافة 15 µL من كاشف Lucifer لكل بئر. نستخدم لوحة 96 بئراً بيضاء معتمة من نوع Perkin S optive plate 96. ثم يتم إضافة 15 µL من مستخلص الخلايا وتحضين اللوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.بعد 10 دقائق، قم بقياس التألق الضوئي باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة. بعد ذلك، قم بإجراء مقايسة اللوسيفيريز الأساسية من أجل الحصول على بيانات البلازميد الضابط. وللقيام بذلك، قم بتحضير الكمية المناسبة من محلول ركيزة اللوسيفيريز مباشرة قبل الاستخدام عن طريق إضافة جزء واحد من كاشف dual glow، stop and glow إلى 100 جزء.محلول Dual glow و Stop and glow buffer. بعد ذلك، أضف 15 µL من محلول الركيزة إلى كل بئر. قم بحضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ثم قم بقياس التألق الحيوي مرة أخرى.يرجى ملاحظة أننا قمنا بتعديل البروتوكول الموصى به من قبل الشركة المصنعة لهذه المقايسات من نوع dual glow ferous. ومن أجل تقليل كمية الكواشف المطلوبة لكل عينة، يمكن الآن تحليل الطبق مرة أخرى باستخدام قارئ الأطباق. وبمجرد جمع البيانات بواسطة قارئ الأطباق الدقيقة، يمكن نقلها إلى برنامج جداول بيانات مثل Microsoft Excel لإجراء مزيد من التحليل.أولاً، احسب المتوسط الحسابي للآبار الثلاثة غير المستأصلة، ثم اطرح هذه القيمة من كل نقطة من نقاط البيانات. بعد ذلك، بالنسبة لكل بئر تم إجراء ترانسفكشن له، اقسم القيمة الخاصة بـ firefly luciferase على قيمة luciferase. ثم قم بحساب المتوسط الحسابي، يليه الانحراف المعياري ومعامل الاختلاف لكل مجموعة من العينات المكررة ثلاث مرات.في مثالنا، نستخدم تركيزات مختلفة من الخرز والتي تم رسمها على المحور x مقابل نسبة نشاط لوسيفيراز اليراعة (firefly) إلى لوسيفيراز الفانيليا (vanilla). وكما تلاحظون، هناك زيادة تعتمد على الجرعة في هذه النسبة. لقد أوضحنا لكم للتو كيفية استخدام مقايسة جينية تقريرية تعتمد على اللوسيفيراز لقياس التعبير عن محفز مستقبل LDL استجابةً لبلعمة خرز اللاتكس.عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التأكد من أن الخلايا وصلت إلى نسبة تلاقي تتراوح بين 80 إلى 90% فقط في وقت عفن الخلايا (transfection). هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.

studying-membrane-biogenesis-with-luciferase-based-reporter-gene

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

مع تزايد الاهتمام في علاجات الخلايا الجذعية ، وتقنيات التصوير الجزيئي مثالية لمراقبة سلوك الخلايا الجذعية بعد الزرع. وقد مكنت الجينات مراسل Luciferase غير الغازية ، وتقييم المتكررة لبقاء الخلية ، والموقع ، وانتشارها في الجسم الحي. وهذا الفيديو لشرح كيفية تعقب انتشار hESC في ماوس المعيشة.

في المختبر والمجراة في ضوء بارد مراسل التصوير الجيني للخلايا منشأ جنينية بشرية

الساعة البيولوجية تعمل الساعات داخل الخلايا الفردية، أي أنها خلية مستقلة. هنا، نحن تصف طرق لتوليد نماذج على مدار الساعة خلية المستقلة باستخدام غير الغازية، وسيفيراز التكنولوجيا القائمة على تلألؤ بيولوجي في الوقت الحقيقي. خلايا مراسل توفير لين العريكة، ونظم نموذج وظيفي لدراسة علم الأحياء الإيقاعية.

رصد الخلية التي تتمتع بحكم ذاتي إيقاعات الساعة اليومية في التعبير الجيني باستخدام مراسلون ضوء بارد وسيفيراز

يوضح الفيديو مقايسة لوسيفيراز المستخدمة لتحديد البروتينات الموسومة باللوسيفيراز. يستخدم الاختبار إنزيم لوسيفيراز مصمم هندسيا يتكون من جزء كبير يرتبط بالجزء الصغير ، والذي يترافق مع بروتين ذي أهمية. تشكل الوحدات الفرعية المرتبطة إنزيما نشطا يطلق إشارة مضيئة في وجود الركيزة. ثم يتم قياس هذه الإشارة باستخدام مقياس الإضاءة.

مقايسة لوسيفيراز: اختبار عالي الإنتاجية لقياس الإشارات المضيئة باستخدام المراسلين الحيويين المعتمدين على نظام النانو لوسيفيراز المصمم هندسيا

يوضح هذا الفيديو مقايسة تكميل لوسيفيراز الانقسام للكشف عن تفاعلات البروتين والبروتين. في هذا الاختبار ، يتم تمييز البروتينات ذات الأهمية على أجزاء صغيرة وكبيرة من إنزيم لوسيفيراز. عندما تتفاعل البروتينات ، تتحد الأجزاء الكبيرة والصغيرة لتشكيل مركب إنزيم نشط ، والذي في وجود ركيزة معينة ، يطلق لمعانا ساطعا يمكن قياسه.

مقايسة تكميل لوسيفيراز سبليت لتحديد تفاعلات محددة بين البروتين والبروتين

نقدم طريقة الفحص السريع وغير مكلفة لتحديد المنظمين النسخي باستخدام عالية الإنتاجية transfections الروبوتية ومحلية الصنع مزدوج توهج luciferase الفحص. هذا البروتوكول يولد بسرعة البيانات المباشرة وظيفية جنبا إلى جنب منذ آلاف الجينات وقابل للتعديل بسهولة لاستهداف أي الجينات في المصالح.

الإنتاجية العالية فحص وظيفية باستخدام محلية الصنع ثنائي توهج luciferase الفحص

التوصل إلى فهم مستوى النظم من العمليات الخلوية هو هدف بيولوجيا الخلية في العصر الحديث. نحن هنا وصف استراتيجيات للصحفيين وسيفيراز المتنوعة من مختلف وظيفة الخلوية نقطة نهاية لاستجواب وظائف الجينات باستخدام الجينوم على نطاق والمكتبات رني.

A تعدد في منصة الفرز القائم على luciferase المراسل لاستجواب المرتبطة بالسرطان نقل الإشارة في الخلايا المستزرعة

ويرد في المختبر الإضاءة الحيوية فحص لتحديد إيقاع circadian الخلوية في الخلايا الظهارية الثديية. ويستخدم هذا الأسلوب خلية الثدييات مراسل والبلازميدات معربا عن زعزعة استقرار لوسيفراس الخاضعة لسيطرة المروج الجينات الفترة 2 . فإنه يمكن تكييفها لأنواع الخلايا الأخرى لتقييم التأثيرات الخاصة بالجهاز على إيقاع سيركاديان.

في المختبر فحص الإضاءة الحيوية تميز إيقاع سيركاديان في الخلايا الظهارية الثديية

لوسيفراس المشفرة وراثيا مراسل غير الغازية شعبية للتعبير الجيني. استخدام لوسيفراس طولية الآلي التصوير مسجل الغاز ودرجة الحرارة الأمثل (التمساح) يتيح تسجيل طولية من الخلايا طرحه تحت طائفة واسعة من الظروف. هنا نعرض كيف يمكن استخدام التمساح في سياق البحوث إيقاعات سيركاديان.

قياس مرونة للصحفيين طرحه باستخدام لوسيفراس طولية الآلي التصوير مسجل الغاز ودرجة الحرارة الأمثل (التمساح)

الجذعية العصبية/الخلايا progenitor يحمل ديناميات التعبير المختلفة من الشق يشير المكونات التي تؤدي إلى نتائج مختلفه من الاحداث الخلوية. ويمكن الكشف عن مثل هذا التعبير الديناميكي عن طريق الرصد في الوقت الحقيقي ، وليس عن طريق التحليل الساكن ، وذلك باستخدام نظام تصويري حساس للغاية للتصوير الضوئي يمكن من تصور التغيرات السريعة في تعابير الجينات.

في الوقت الحقيقي التصوير الضوئي التلالؤ من الدرجة ديناميات الإشارات اثناء التكوين العصبي Murine

قمنا بتطوير فحص مراسل التكوين الحيوي للحمض النووي الريبوزي المرسال الميكروي الإنتروني لاستخدامه في الخلايا في المختبر مع أربعة بلازميدات: واحد مع miRNA intronic ، واحد مع الهدف ، واحد للمبالغة في التعبير عن بروتين تنظيمي ، وواحد ل Renilla luciferase. تمت معالجة miRNA ويمكنه التحكم في تعبير luciferase عن طريق الارتباط بالتسلسل المستهدف.

فحص مراسل لتحليل نضج الحمض النووي الريبي الميكروي الإنتروني في خلايا الثدييات

تنظم إيقاعات الساعة البيولوجية ، الموجودة في معظم الكائنات الحية ، التنظيم الزمني للعمليات البيولوجية. ظهرت المواد العضوية 3D مؤخرا كنموذج ذي صلة من الناحية الفسيولوجية في المختبر . يصف هذا البروتوكول استخدام مراسلي التوهج الحيوي لمراقبة إيقاعات الساعة البيولوجية في المواد العضوية ، مما يتيح إجراء تحقيقات في المختبر لإيقاعات الساعة البيولوجية في الأنظمة متعددة الخلايا.

مراقبة تذبذبات الساعة البيولوجية باستخدام مراسل التلألؤ البيولوجي في المواد العضوية

اكتشف كيفية دراسة التعبير الجيني المستحث بالبلعمة باستخدام تقنية Luciferase المستندة. يوضح هذا البروتوكول تحليل تنظيم الجينات المشاركة في تكوين الأغشية الخلوية.

دراسة النشوء الأحيائي الأغشية مع الفحص الجيني مراسل Luciferase المستندة

استكشف المزيد من الفيديوهات