Name: جعل التصحيح ، وماصات أقطاب شارب مع بولير برمجة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: تعلم إعداد أقطاب التصحيح والأقطاب الحادة للفيزيولوجيا الكهربائية باستخدام الساحب القابل للبرمجة. يوضح هذا الفيديو تقنيات طلاء الشمع وتلميع النار لضمان جودة الأقطاب الزجاجية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نشكر وكالات التمويل والمؤسسات التالية للحصول على الدعم : المعاهد القومية للصحة ، المؤسسة الوطنية للعلوم ، الجمعية الأمريكية للقلب ، الضمور العضلي جمعية ، ودونالد وباء ديليا E. مؤسسة باكستر ، وصندوق الوقف وKlingenstein ماكنايت علم الأعصاب.

سحب ماصات باستخدام microelectrode مجتذب مثل سوتر P - 97 يلهب / براون ، سحب مجموعة من حوالي 10-20 الماصات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد الزجاج الخاص الشعرية. نستخدم البورسليكات الشعيرات الدموية (سوتر BF150 - 110 - 10 ، القطر الخارجي 1.5mm ، 1.1mm قطرها الداخلي ، 10cm طويلة). مخزن الزجاج بعناية بحيث يبقى نظيفا والغبار الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصميم برنامج الانسحاب. نستخدم برنامج الخطوة 5 ، مع الحرارة وسرعة التنازلي في كل خطوة ، وسحب صغيرة على الخطوة النهائية. سوتر في ماصة كتاب طبخ مرجعا ممتازا لتطوير برامج مناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دراسة نصائح ماصة تحت المجهر لتحديد قطرها الافتتاح وسلاسة. تجاهل الخام ، نصائح متفاوتا ، أو غير منتظمة. وينبغي أن يكون بروتوكول جيدة ضمان سحب هذه نادرة. لتسجيل التصحيح ، المشبك القياسية ، يجب أن تكون فتحات غيض 1-3 ميكرون في القطر. وتفتق الحاد (كليلة غيض) يؤدي إلى انخفاض المقاومة لفتح القطر نفسه. يمكن تعديل شكل وحجم الضغوط التي التلميع. </li></ol> ماصات النار تلميع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اقامة منصة تلميع (microforge) مع خيوط البلاتين التدفئة التي يسيطر عليها دواسة القدم. وهناك عدة مفيدة يتوفر من العلم ALA (CPM - 2) يمكن تجميعها أو جهاز مماثل مجزأة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري : معطف ماصة مع عازل لتخفيض السعة وتحسين خصائص الضوضاء. نحن نستخدم الشمع الأسنان. Sylgard 184 ™ (بولي ميثيل siloxane الاستومر المعروف أيضا باسم PDMS) هو أيضا خيار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا باستخدام الشمع ، والحفاظ على كميات صغيرة المنصهر في مكان قريب. مع الضغط الجوي على الجزء الخلفي من ماصة للحفاظ على الشمع من دخول ماصة ، وتراجع لفترة وجيزة تلميح إلى الشمع السائل وإزالته. مع Sylgard وتخزين الاستومر أعد في aliquots المجمدة والطلاء غيض ماصة تحت المجهر. الحرارة لعلاج الاستومر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع ماصة (مغلفة أو لا) في جهاز تلميع وتقديم نصيحة ~ 50 ميكرون من خيوط. نضع في اعتبارنا أن خيوط سوف توسع عند تسخينها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وأوصت : اتبع بروتوكول منفصل عن &quot;تلميع الضغط&quot; لتغيير شكل ماصة للمقاومة الأمثل وقطر الحافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نبضة قصيرة الحرارة (1-2 ثوان) كافية لإزالة الشمع من غيض من ماصة وناعمة الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع ماصة الانتهاء في صندوق مغلق للحماية من الغبار ، وكرر لمدة 10 ماصات ناجحة. </li></ol>

<ol><li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

ويوضح البروتوكول هو هنا في الاستخدام اليومي في المختبرات الكهربية وتستخدم أيضا لصنع إبر الحقن للخلايا والحيوانات. مع مجتذب برمجة ، فمن السهل أن تجعل ماصات لمجموعة متنوعة من الاستخدامات. مع الاهتمام والرعاية ، فإن خيوط مجتذب الخاص على الماضي لمدة سنة واحدة أو أكثر. حظا سعيدا مع التجارب الخاصة بك.

<table><tbody><tr><td>جهاز سحب الماصات الدقيقة</td><td>أداة</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>أو أداة مماثلة (مثل Sutter P-87 أو P-2000)</td></tr><tr><td>أنابيب شعرية زجاجية</td><td>كاشف</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-86-10</td><td>أو زجاج شعري مماثل. ولتسهيل عملية ملء الماصة، استخدم أنبوباً شعرياً يحتوي على فتيلة زجاجية.</td></tr></tbody></table>

جعل التصحيح ، وماصات أقطاب شارب مع بولير برمجة

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

وقد microelectrodes الزجاج (وتسمى أيضا الماصات) في العمود الفقري لالكهربية على مدى عقود. اليوم ، يتم إجراء من هذا القبيل من الشعيرات الدموية الماصات الزجاج باستخدام مجتذب برمجة. هذه الصكوك الحرارة الشعرية إما باستخدام خيوط معدنية أو الليزر واستخلاص الزجاج باستخدام الجاذبية ، والسيارات أو كليهما. يتم تشكيل لماصات التصحيح ، المشبك تسجيل استخدام الحرارة فقط ، والجاذبية ، بينما الأقطاب حادة لتسجيل الخلايا استخدام مزيج من الحرارة والجاذبية ، والحركية ملف. الإجراء التي استخدمت لصنع الخلايا الماصة تسجيل مماثلة لتلك التي استخدمت لصنع إبر الحقن لمجموعة متنوعة من التطبيقات ، بما فيها الحقن في كرنا القيطم البويضات. في الزجاج ، ويستخدم عامة الشعرية &lt;1.2 مم في القطر لجعل ماصات لتسجيل المشبك التصحيح ، بينما يستخدم لتسجيل أضيق الزجاج داخل الخلايا (القطر الخارجي = 1.0 ملم). لكل أداة ، هو برمجة مجتذب مختلف قليلا. هذا الفيديو يبين كيفية جعل كلا النوعين من ماصات تسجيل مجتذب باستخدام برامج محددة مسبقا.

هذا الفيديو يوضح كيفية استخدام مجتذب برمجة لجعل ماصات التصحيح والأقطاب الكهربية حادة ل. ويمكن استخدام نفس الإجراء لتقديم مجموعة متنوعة من الأدوات الزجاجية ، بما في ذلك إبر الحقن.

تُعد الأقطاب الكهربائية الزجاجية الدقيقة (والتي تُسمى أيضاً الماصّات) أداة أساسية في الفيزيولوجيا الكهربائية منذ عقود. وفي الوقت الحاضر، تُصنع هذه الماصّات من شعيرات زجاجية...

أصبحت الماصات الشعرية الزجاجية منتشرة في المختبرات لمجموعة واسعة من التقنيات، مثل التثقيب الكهربائي للخلية الواحدة، والحقن المجهري للحمض النووي DNA، والفيزيولوجيا الكهربائية بتقنية تثبيت الرقعة (patch clamp). لتحضير أقطاب تثبيت الرقعة الشعرية الزجاجية من أجل التسجيلات، يتم سحب الزجاج السيليكاتي باستخدام جهاز سحب قابل للبرمجة. تُطلى رؤوس الأقطاب بالشمع، ثم تُصقل هذه الرؤوس بالحرارة وتُخزن لاستخدامها مستقبلاً. مرحباً، أنا ميريام غودمان من قسم الفيزيولوجيا الجزيئية والخلوية بجامعة ستانفورد.سأقوم في هذا الفيديو بتوضيح كيفية صنع ماصات تثبيت الجهد (patch clamp pipettes) والأقطاب الحادة المستخدمة في الفسيولوجيا الكهربائية. لقد كانت الأقطاب المجهرية الزجاجية، والتي تُسمى أيضاً بالماصات، الأداة الأساسية في الفسيولوجيا الكهربائية لعقود من الزمن. واليوم، يتم تصنيع هذه الماصات من الشعيرات الزجاجية باستخدام جهاز سحب قابل للبرمجة.لنبدأ الآن. لصناعة ماصات تثبيت الجهد (patch clamp pipettes)، نستخدم شعيرات بوريك من شركة Sutter في شعيرات دموية نظيفة وخالية من الغبار، ونستخدم جهاز سحب الأقطاب الكهربائية الدقيقة بالتسخين Sutter P-97. ويعد "كتاب طبخ الماصات" (Pipette Cookbook) من شركة Sutter مرجعاً ممتازاً لتطوير برامج سحب مناسبة.للبدء، ارفع غطاء الغبار الموجود على جهاز سحب الأنابيب الشعرية. ثم خذ أنبوباً شعرياً زجاجياً واحداً من العلبة. تأكد من إعادة وضع الغطاء لتقليل تراكم الغبار.بعد ذلك، قم بتمرير الأنبوب الشعري بيد واحدة في الأخدود الموجود على أحد جانبي الفتيلة، ثم أحكم ربط المشبك قليلاً. في هذه المرحلة، يجب أن يكون المشبك محكماً بما يكفي لمنع سقوط الأنبوب، ولكن مرناً بما يكفي للسماح بتمريره داخل الأخدود. والآن، حرر مصد المعدن الزنبركي الموجود على الجانب نفسه.بعد ذلك، أمسك بإبهامك وسبابتك الألسنة المعدنية المثبتة في الجزء السفلي من كلا الحاملين. حرر سدادة التوقف المعدنية الزنبركية الأخرى. اسحب الحاملين معًا إلى أقصى حد ممكن وثبتهما في مكانهما بيد واحدة.بعد ذلك، مرر الأنبوب عبر مبيت السلك المتوهج إلى أخدود الحامل في الجانب الآخر. تجنب دفع الزجاج باتجاه السلك المتوهج. أحكم ربط المشابك على كلا الجانبين.يجب أن تكون هذه الروابط محكمة بما يكفي لتثبيت الحوامل في مكانها، ولكن ليس لدرجة تؤدي إلى سحق الزجاج. الآن، أغلق غطاء الغبار واضغط على الزر الأخضر. يتم تشكيل ماصات الأقطاب ذات الرؤوس المدببة المستخدمة في تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp) باستخدام برنامج سحب مكون من خمس خطوات، مع خفض درجة الحرارة والسرعة في كل خطوة، وتشكيل قطب صغير في الخطوة النهائية.يعتمد هذا البرنامج على الحرارة والجاذبية. وتتشابه إجراءات صنع أقطاب كهربائية حادة إلى حد كبير، ولكن في هذه الحالة، نستخدم شعيرة زجاجية رفيعة من شركة Warner Instruments بقطر خارجي يبلغ 1 مليمتر وقطر داخلي يبلغ 0.78 مليمتر. كما نطبق برنامج سحب يستخدم محركاً بالإضافة إلى الحرارة والجاذبية عند الانتهاء من برامج السحب.ارفع غطاء الغبار، وقم بفك كلا المشبكين ثم أخرج الماصة الجاهزة. بعد ذلك، ضع الماصات في صندوق عمل. يمكن صنع هذا الصندوق عن طريق لصق شريط من الرغوة (الفوم) على حامل صندوق رؤوس الماصات البلاستيكي، ثم قص ست إلى ثماني شقوق في الرغوة.أدخل الماصّات في الشقوق. بمجرد امتلاء الصندوق بالماصّات المسحوبة، انتقل إلى خطوة الصقل بالنار لصقل الماصّات. قم بإعداد جهاز صهر دقيق مزود بفتيلة تسخين من البلاتين يتم التحكم فيها بواسطة دواسة قدم قبل البدء في عملية الصقل بالنار.أولاً، قم بتغليف الماصة بشمع الأسنان لتقليل السعة الكهربائية وتحسين خصائص الضوضاء. وللقيام بذلك، احتفظ بكمية صغيرة من الشمع المنصهر في مكان قريب. طبق ضغط هواء على الجزء الخلفي من الماصة لمنع دخول الشمع إلى الطرف.ثم اغمس الطرف لفترة وجيزة في الشمع السائل، ثم أخرجه. ضع الماصة في جهاز التلميع وقرّب الطرف لمسافة 50 microns تقريبًا من الفتيل.ضع في اعتبارك أن الفتيل سيتمدد عند التسخين. قم بتطبيق نبضة حرارية قصيرة لمدة ثانية واحدة أو ثانيتين لإزالة الشمع من طرف الماصة وتسوية الزجاج. افحص أطراف الماصة تحت المجهر لتحديد قطر الفتحة ومدى نعومتها.بالنسبة لتسجيلات تثبيت الرقعة القياسية، يجب أن تتراوح فتحات الطرف ما بين 1 إلى 3 ميكرون في القطر، مع التخلص من الأطراف الخشنة أو غير المستوية أو غير المنتظمة. ضع الماصة المكتملة في صندوق العمل، مع التأكد من إغلاق الغطاء لحماية الماصات من الغبار، وكرر العملية حتى يتم تحضير 10 مصاصات بنجاح. لقد شرحت لك للتو كيفية صنع مصاصات تثبيت الرقعة والأقطاب الكهربائية الحادة باستخدام جهاز سحب قابل للبرمجة.يمكن استخدام الإجراء نفسه لصنع مجموعة متنوعة من الأدوات الزجاجية، بما في ذلك إبر الحقن للحصول على أفضل نتائج لتثبيت الرقعة (patch clamp). ومن المهم تذكر سحب ماصات جديدة خالية من الغبار في نفس يوم التجربة، وصقلها خلال ساعة واحدة من بدء التجربة. كما يجب التحقق من خلال الفحص من أن الماصات ملساء ومصقولة.تأكد من مشاهدة الفيديو الآخر، الذي يوضح كيفية إجراء تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp recording) للقنوات الأيونية التي يتم التعبير عنها في بويضات opus. حسناً، هذا كل شيء. لقد أصبحت الآن خبيراً في استخدام الماصات، وحظاً موفقاً في تجاربك.

making-patch-pipettes-and-sharp-electrodes-with-a-programmable-puller

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هذا هو دليل على تعديل شكل micropipettes الزجاج. على وجه التحديد ، وذلك باستخدام الحرارة والضغط الجوي وتوسيع تفتق دون زيادة افتتاح الطرف ، مما يؤدي إلى انخفاض المقاومة ماصة. هذا أمر بالغ الأهمية للحصول على تسجيلات ضوضاء منخفضة من خلايا صغيرة لكنها مفيدة في العديد من التطبيقات.

الضغط تلميع الماصات لتسجيل باتش تحسين المشبك

طبقات ثنائية الدهون مستو ، وتسمى أيضا طبقات ثنائية الدهون الاصطناعية ، ويسمح لك لإجراء دراسة ايون القنوات في بيئة محددة جيدا. هنا ، علينا أن نظهر الخطوات الفردية اللازمة لاعداد غرفة طبقة ثنائية ، الأقطاب الكهربائية وكيفية اختبار أن طبقة ثنائية مناسبة للقياسات قناة واحدة.

إعداد طبقات ثنائية الاصطناعي للتجارب الكهربية

طريقة موثوقة ذات كفاءة...

الاستراتيجية الأمثل للتعبير وترنسفكأيشن تسجيل الكهربية المؤتلف من القنوات ايون الجهد بوابات - 293T كلوة الجنين البشري في خلايا

نحن هنا وصف طريقة سريعة وبسيطة لقياس صلابة الخلية. المبدأ العام لهذا النهج هو لقياس تشوه الغشاء استجابة لضغوط واضحة المعالم من خلال تطبيق السلبية micropipette إلى سطح الخلية. هذا الأسلوب يوفر أداة قوية لدراسة خصائص النشاط الحيوي للخلايا الركيزة المرفقة.

شفط Micropipette من خلايا الركيزة المرفقة لتقدير تصلب الخليوي

الرحلان الشاردي من منبهات عصبية والخصوم خلال خارج...

تصنيع واستخدام الخنزير ظهر أقطاب لMultibarrel<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التلاعب الدوائية من الردود العصبية

متعدد القطب التسجيلات التصحيح، المشبك يشكل مهمة معقدة. نحن هنا تظهر كيف، من خلال أتمتة العديد من الخطوات التجريبية، فمن الممكن لتسريع عملية تؤدي إلى تحسن نوعي في الأداء وعدد من التسجيلات.

A-متعدد القطب نظام التصحيح، المشبك بمساعدة الحاسوب

قنوات mechanosensitive البكتيرية ويمكن استخدام محولات mechanoelectrical في الأجهزة الجزيئية البيولوجية. طبقات ثنائية اجهة قطرة (الدبس)، اللبنات مستوحاة من الخلية إلى هذه الأجهزة، وتمثل منصات جديدة لدمج وتحفيز قنوات mechanosensitive. هنا، علينا أن نظهر طريقة القائم على micropipette الجديد من تشكيل الدبس، والسماح للدراسة قنوات mechanosensitive تحت التحفيز الميكانيكي.

متعددة الوظائف، طريقة Micropipette القائم لتأسيس وتحفيز القنوات Mechanosensitive البكتيرية ايون في القطرة واجهة طبقات ثنائية

نقدم طرقا لبناء أقطاب كهربائية لتسجيل النشاط العصبي خارج الخلية في وقت واحد وإطلاق مواد عصبية متعددة بالقرب من مواقع التسجيل في الفئران المستيقظة. تسمح هذه التقنية بالتحليل التفصيلي للمدخلات المشبكية المحلية المفترضة للخلايا العصبية ذات الأهمية.

خارج الخلية تسجيل النشاط العصبية جنبا إلى جنب مع Microiontophoretic تطبيق المواد Neuroactive في الفئران مستيقظا

يمكن تسجيل التيارات متشابك فوكالي من تصور boutons متشابك في الوصلات العصبية العضلية يرقات الطور المورفولوجية الثالثة. هذا الأسلوب يتيح رصد نشاط بوتون واحد متشابك.

تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من الوصلات العصبية العضلية اليرقات المورفولوجية

ويصف هذه المخطوطة تطبيقات أقطاب انتقائية بروتون والتصحيح لقط أساليب لقياس نشاط نظم النقل بروتون. هذه الأساليب التغلب على بعض القيود المفروضة على التقنيات المستخدمة عادة لدراسة نشاط النقل بروتون، مثل الحساسية معتدل ووقت القرار ومراقبة الوسط داخل الخلية غير كافية.

تطبيق القياس الكهربية لدراسة نشاط الناقلين محايدة الكهربائية

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل طريقة لقياس نشاط القناة الأيونية مباشرة على الحويصلات داخل الخلايا باستخدام نظام مشبك التصحيح اليدوي داخل اليزوسوم. نوضح الطريقة التي تتضمن تكبير الجسيمات الداخلية وعزل هذه الحويصلات يدويا. يضمن هذا النهج أن الباحثين يمكنهم تكرار الإجراء وتطبيقه بدقة.

تقنيات المشبك الرقعة لتحليل الحويصلة الداخلية الفردية

تعلم إعداد أقطاب التصحيح والأقطاب الحادة للفيزيولوجيا الكهربائية باستخدام الساحب القابل للبرمجة. يوضح هذا الفيديو تقنيات طلاء الشمع وتلميع النار لضمان جودة الأقطاب الزجاجية.

جعل التصحيح ، وماصات أقطاب شارب مع بولير برمجة

استكشف المزيد من الفيديوهات