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Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Broad Institute

&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x6211;&#x4EEC;&#x62A5;&#x544A;&#x56FD;&#x5185;&#x72D7; &#xFF08;&#x72AC; familiaris&#xFF09;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x5355;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x591A;&#x6001;&#x6027; (SNPs) &#x8DE8;&#x54C1;&#x79CD;&#x5BC6;&#x96C6;&#x5730;&#x56FE;&#x8349;&#x7A3F;&#x9AD8;&#x8D28;&#x91CF;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x5E8F;&#x5217;&#x3002;&#x72D7;&#x662F;&#x7279;&#x522B;&#x611F;&#x5174;&#x8DA3;&#x7684;&#x56E0;&#x4E3A;&#x5B83;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x8FDB;&#x5316;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x4FE1;&#x606F;&#xFF0C;&#x56E0;&#x4E3A;&#x73B0;&#x6709;&#x54C1;&#x79CD;&#x663E;&#x793A;&#x5927;&#x8868;&#x578B;&#x591A;&#x6837;&#x6027;&#x7684;&#x5F62;&#x6001;&#x3001; &#x751F;&#x7406;&#x548C;&#x884C;&#x4E3A;&#x7279;&#x5F81;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x5E8F;&#x5217;&#x6BD4;&#x8F83;&#x4E0E;&#x7075;&#x957F;&#x7C7B;&#x548C;&#x556E;&#x9F7F;&#x52A8;&#x7269;&#x8C31;&#x7CFB;&#x63ED;&#x793A;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x8FDB;&#x5316;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x548C;&#x57FA;&#x56E0;&#x3002;&#x503C;&#x5F97;&#x6CE8;&#x610F;&#x7684;&#x662F;&#xFF0C;&#x5927;&#x591A;&#x6570;&#x54FA;&#x4E73;&#x52A8;&#x7269;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x4E2D;&#x7684;&#x6700;&#x9AD8;&#x4FDD;&#x5B88;&#x975E;&#x7F16;&#x7801;&#x5E8F;&#x5217;&#x90FD;&#x805A;&#x96C6;&#x9644;&#x8FD1;&#x4E0E;&#x53D1;&#x5C55;&#x4E2D;&#x7684;&#x91CD;&#x8981;&#x4F5C;&#x7528;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7684;&#x4E00;&#x5C0F;&#x90E8;&#x5206;&#x3002;&#x5355;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x591A;&#x6001;&#x6027;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x63ED;&#x793A;&#x4E86;&#x8FDC;&#x8DDD;&#x79BB;&#x7684;&#x5355;&#x500D;&#x578B;&#x8DE8;&#x6574;&#x4E2A;&#x72D7;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5B9A;&#x4E49;&#x5185;&#x548C;&#x8DE8;&#x79CD;&#x7FA4;&#x7684;&#x9057;&#x4F20;&#x591A;&#x6837;&#x6027;&#x7684;&#x6027;&#x8D28;&#x3002;&#x5F53;&#x524D;&#x7684;&#x5355;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x591A;&#x6001;&#x6027;&#x5730;&#x56FE;&#x73B0;&#x5728;&#x4F7F;&#x5F97;&#x5B83;&#x7684;&#x5168;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x5173;&#x8054;&#x7814;&#x7A76;&#xFF0C;&#x786E;&#x5B9A;&#x57FA;&#x56E0;&#x75BE;&#x75C5;&#x548C;&#x6027;&#x72B6;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x4F34;&#x4FA3;&#x52A8;&#x7269;&#x5065;&#x5EB7;&#x548C;&#x4EBA;&#x6743;&#x91CD;&#x8981;&#x540E;&#x679C;&#x8D1F;&#x8D23;&#x3002;

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Here we report a high-quality draft genome sequence of the domestic dog (Canis familiaris), together with a dense map of single nucleotide polymorphisms (SNPs) across breeds. The dog is of particular interest because it provides important evolutionary information and because existing breeds show great phenotypic diversity for morphological, physiological and behavioural traits. We use sequence comparison with the primate and rodent lineages to shed light on the structure and evolution of genomes and genes. Notably, the majority of the most highly conserved non-coding sequences in mammalian genomes are clustered near a small subset of genes with important roles in development. Analysis of SNPs reveals long-range haplotypes across the entire dog genome, and defines the nature of genetic diversity within and across breeds. The current SNP map now makes it possible for genome-wide association studies to identify genes responsible for diseases and traits, with important consequences for human and companion animal health.

Genome sequence, comparative analysis and haplotype structure of the domestic dog.

Nous rapportons ici une s&#xE9;quence de haute qualit&#xE9; brouillon du g&#xE9;nome du chien domestique (Canis familiaris), accompagn&#xE9; d&#x26;#39;une carte dense de polymorphismes nucl&#xE9;otidiques simples (SNP) entre races. Le chien est d&#x26;#39;un int&#xE9;r&#xEA;t particulier car elle fournit des informations importantes de l&#x26;#39;&#xE9;volution et parce que les races existantes montrent une grande diversit&#xE9; ph&#xE9;notypique des traits morphologiques, physiologiques et comportementaux. Nous utilisons la comparaison de s&#xE9;quences avec les lign&#xE9;es de primates et de rongeurs de faire la lumi&#xE8;re sur la structure et l&#x26;#39;&#xE9;volution des g&#xE9;nomes et des g&#xE8;nes. Notamment, la majorit&#xE9; des plus hautement conserv&#xE9;es s&#xE9;quences non-codantes dans les g&#xE9;nomes de mammif&#xE8;res sont regroup&#xE9;s pr&#xE8;s d&#x26;#39;un petit sous-ensemble de g&#xE8;nes avec des r&#xF4;les importants dans le d&#xE9;veloppement. L&#x26;#39;analyse des SNPs r&#xE9;v&#xE8;le &#xE0; long terme haplotypes &#xE0; travers le g&#xE9;nome du chien entier, et d&#xE9;finit la nature de la diversit&#xE9; g&#xE9;n&#xE9;tique au sein et entre races. Le courant SNP carte, il est d&#xE9;sormais possible pour l&#x26;#39;ensemble du g&#xE9;nome des &#xE9;tudes d&#x26;#39;association &#xE0; identifier les g&#xE8;nes responsables de maladies et des traits, avec des cons&#xE9;quences importantes pour la sant&#xE9; animale de l&#x26;#39;homme et son compagnon.

Genome Sequence, Analyse comparative et structure haplotype du chien domestique

Hier berichten wir eine qualitativ hochwertige Entwurf-Genom-Sequenz des Haushundes (Canis Familiaris), zusammen mit einer dichten Karte von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) &uuml;ber Rassen. Der Hund ist von besonderem Interesse, da es wichtige evolution&auml;re Informationen bereitstellt und vorhandene Rassen gro&szlig;e ph&auml;notypische Vielfalt f&uuml;r Verhaltensst&ouml;rungen, morphologische und physiologische Merkmale zeigen. Wir verwenden Sequenz-Vergleich mit dem Primas und Nagetier-&Uuml;bertragungslinien, um Aufschluss &uuml;ber die Struktur und Entwicklung der Genome und Gene. Insbesondere sind die Mehrheit der meisten stark konservierten nicht-kodierenden Sequenzen in S&auml;ugetier-Genome gruppiert, in der N&auml;he eine kleine Teilmenge der Gene mit wichtigen Rollen in der Entwicklung. Analyse von SNPs Langstrecke Haplotypen &uuml;ber den gesamten Hund-Genoms offenbart, und definiert die Art der genetischen Vielfalt innerhalb und zwischen den Rassen. Die aktuelle SNP-Karte ist es jetzt m&ouml;glich f&uuml;r Genome-Wide Association Studies f&uuml;r Krankheiten und Z&uuml;ge, mit Konsequenzen f&uuml;r Mensch und Begleiter Tiergesundheit verantwortlichen Gene zu identifizieren.

Genom-Sequenz, vergleichende Analyse und Haplotype Struktur des inl&auml;ndischen Hundes.

Qui riportiamo una sequenza del genoma di alta qualit&agrave; bozza del cane domestico (Canis familiaris), insieme a una fitta mappa di polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs) attraverso razze. Il cane &egrave; di particolare interesse perch&eacute; fornisce importanti informazioni evolutive e razze esistenti mostrano grande diversit&agrave; fenotipica per tratti morfologici, fisiologici e comportamentali. Usiamo il confronto di sequenza con il primate e lignaggi roditore di gettare luce sulla struttura e sull&#39;evoluzione di geni e genomi. In particolare, la maggior parte delle sequenze non codificanti pi&ugrave; altamente conservate nei genomi dei mammiferi &egrave; raggruppata vicino un piccolo sottoinsieme dei geni con ruoli importanti nello sviluppo. Analisi di SNPs rivela aplotipi a lungo raggio in tutto il genoma del cane intero e definisce la natura della diversit&agrave; genetica all&#39;interno e tra razze. La mappa attuale di SNP rende possibile per gli studi di associazione genome-wide per identificare i geni responsabili di malattie e tratti, con importanti conseguenze per l&#39;uomo e la salute animale compagno.

Sequenza del genoma, analisi comparativa e struttura aplotipo del cane domestico.

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&#xC5EC;&#xAE30; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xD488;&#xC885;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xB2E8;&#xC77C; &#xB274;&#xD074;&#xB808;&#xC624;&#xD2F0;&#xB4DC; polymorphisms (Snp)&#xC758; &#xBC00;&#xB3C4; &#xC9C0;&#xB3C4; &#xD568;&#xAED8; &#xAD6D;&#xB0B4; &#xAC1C; (Canis familiaris)&#xC758; &#xB192;&#xC740;-&#xD488;&#xC9C8; &#xCD08;&#xC548; &#xAC8C;&#xB188; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB97C; &#xBCF4;&#xACE0;. &#xAC1C;&#xAC00; &#xC9C4;&#xD654; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC815;&#xBCF4;&#xB97C; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xD558; &#xACE0; &#xAE30;&#xC874; &#xD488;&#xC885; &#xD45C;&#xC2DC; &#xD615;&#xD0DC;, &#xC0DD;&#xB9AC; &#xBC0F; &#xD589;&#xB3D9; &#xD2B9;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD6CC;&#xB96D;&#xD55C; phenotypic &#xB2E4;&#xC591;&#xC131; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xD2B9;&#xD788; &#xAD00;&#xC2EC;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC640; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC9C4;&#xD654;&#xC640; &#xAD6C;&#xC870;&#xC5D0; &#xBE5B;&#xC744; &#xBC1C;&#xC0B0; &#xD558; &#xAC8C; &#xC601;&#xC7A5;&#xB958; &#xBC0F; &#xC124;&#xCE58;&#xB958; lineages &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xBE44;&#xAD50;&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD2B9;&#xD788;, &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC758; &#xD3EC;&#xC720;&#xB958; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xAC00;&#xC7A5; &#xB192;&#xC740; &#xBCF4;&#xC874;&#xB41C; &#xBE44; &#xCF54;&#xB529; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xAC1C;&#xBC1C;&#xC5D0; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xC5ED;&#xD560;&#xC744; &#xAC00;&#xC9C4; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xC791;&#xC740; &#xBD80;&#xBD84; &#xC9D1;&#xD569; &#xADFC;&#xCC98; &#xD074;&#xB7EC;&#xC2A4;&#xD130; &#xB41C;. Snp &#xBD84;&#xC11D; &#xC804;&#xCCB4; &#xAC1C; &#xAC8C;&#xB188;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xC7A5;&#xAC70;&#xB9AC; haplotypes &#xACC4;&#xC2DC; &#xACE0; &#xD488;&#xC885;&#xC5D0; &#xAC78;&#xCCD0; &#xC720;&#xC804;&#xC801; &#xB2E4;&#xC591;&#xC131;&#xC758; &#xD2B9;&#xC131;&#xC744; &#xC815;&#xC758; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD604;&#xC7AC; SNP &#xC9C0;&#xB3C4; &#xC9C0;&#xAE08; &#xC720;&#xC804;&#xC790; &#xC9C8;&#xBCD1; &#xBC0F; &#xC778; &#xAC04;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xACB0;&#xACFC;&#xC640; &#xB3D9;&#xBC18;&#xC790; &#xB3D9;&#xBB3C; &#xAC74;&#xAC15; &#xD2B9;&#xC131;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCC45;&#xC784;&#xC744; &#xC2DD;&#xBCC4; &#xD558;&#xB294; &#xAC8C;&#xB188; &#xB113;&#xC740; &#xD611;&#xD68C; &#xC5F0;&#xAD6C;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xAC8C;&#xB188; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;, &#xBE44;&#xAD50; &#xBD84;&#xC11D; &#xBC0F; &#xAD6D;&#xB0B4; &#xAC1C; haplotype &#xAD6C;&#xC870;.

Aqu&#xED; se presenta un borrador de secuencia de alta calidad del genoma del perro dom&#xE9;stico (Canis familiaris), junto con un mapa denso de polimorfismos de nucle&#xF3;tido &#xFA;nico (SNP) a trav&#xE9;s de las razas. El perro es de particular inter&#xE9;s ya que proporciona informaci&#xF3;n importante y de la evoluci&#xF3;n, porque las razas existentes muestran una gran diversidad fenot&#xED;pica de los rasgos morfol&#xF3;gicos, fisiol&#xF3;gicos y de comportamiento. Nuestro m&#xE9;todo de comparaci&#xF3;n de secuencias con los linajes de primates y roedores para arrojar luz sobre la estructura y evoluci&#xF3;n de los genomas y genes. Cabe destacar que la mayor&#xED;a de los m&#xE1;s altamente conservadas las secuencias no codificantes en genomas de mam&#xED;feros se agrupan cerca de un peque&#xF1;o subconjunto de genes con funciones importantes en el desarrollo. El an&#xE1;lisis de los SNP revela a largo plazo a trav&#xE9;s de haplotipos del genoma del perro, y define la naturaleza de la diversidad gen&#xE9;tica dentro y entre las razas. El actual mapa de SNP, ahora es posible para todo el genoma estudios de asociaci&#xF3;n para identificar los genes responsables de enfermedades y caracter&#xED;sticas, con importantes consecuencias para la salud humano y el animal.

Secuencia del Genoma, el an&#xE1;lisis comparativo y la estructura de haplotipos del perro dom&#xE9;stico

&#x9488;&#x5BF9;&#x5927;&#x89C4;&#x6A21;&#x5E76;&#x884C;&#x5E8F;&#x5217;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#x4F4D;&#x70B9;&#x9700;&#x8981;&#x4E30;&#x5BCC;&#x6A21;&#x677F;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x88AB;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x7684;&#x65B0;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5236;&#x5B9A;&#x4E00;&#x4E2A;&#x6355;&#x83B7;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x7528;&#x7D20; RNA &#x9975;&#xFF0C;&#x5230;&#x9C7C;&#x76EE;&#x6807;&#x4ECE;&#x6C60;&#x5858;&#x7684; DNA &#x7247;&#x6BB5;&#x3002;RNA &#x662F;&#x4ECE; PCR &#x6269;&#x589E;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x82AF;&#x7247;&#x4E0A;&#x6700;&#x521D;&#x5408;&#x6210;&#x8F6C;&#x5F55;&#x751F;&#x6210;&#x591A;&#x4E2A;&#x6355;&#x83B7;&#x6D53;&#x5EA6;&#x8DB3;&#x591F;&#x9AD8;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x63A8;&#x52A8;&#x6742;&#x4EA4;&#x7684;&#x8DB3;&#x591F;&#x8BF1;&#x9975;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x6B64;&#x65B9;&#x6CD5;&#x4E0E; 170 mer &#x9975;&#x8FD9;&#x4E00;&#x76EE;&#x6807; &gt; 15,000 &#x7F16;&#x7801;&#x7528; (2.5 Mb) &#x548C;&#x56DB;&#x4E2A;&#x5730;&#x533A; (1.7 Mb &#x603B;) &#x4F5C;&#x4E3A;&#x8BFB;&#x51FA;&#x4F7F;&#x7528;&#x7167;&#x6392;&#x80F6;&#x7247;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x3002;&#x7EA6; 90%&#x7684;&#x552F;&#x4E00;&#x5BF9;&#x9F50;&#x57FA;&#x5730;&#x843D;&#x4E0A;&#x6216;&#x9644;&#x8FD1;&#x9975;&#x5E8F;&#x5217; &#xFF1B;&#x9AD8;&#x8FBE; 50%&#x8EBA;&#x7740;&#x7528;&#x6B63;&#x786E;&#x3002;&#x7EDF;&#x4E00;&#x6027;&#x662F;&#x8FD9;&#x6837;&#xFF0C;&#x5927;&#x7EA6; 60%&#x7684;&#x76EE;&#x6807;&#x57FA;&#x5730;&#x5728; exonic &#39;&#x8FFD;&#39; &#x548C;&#x5927;&#x7EA6; 80%&#x533A;&#x57DF;&#x7684;&#x6E14;&#x83B7;&#xFF0C;&#x5DF2;&#x81F3;&#x5C11;&#x4E00;&#x534A;&#x7684;&#x5E73;&#x5747;&#x8986;&#x76D6;&#x7387;&#x3002;&#x7167;&#x6392;&#x80F6;&#x7247;&#x5E8F;&#x5217;&#x7684;&#x4E00;&#x6761;&#x884C;&#x8F66;&#x7EBF;&#x662F;&#x8DB3;&#x591F;&#x9AD8;&#x4FE1;&#x5FC3;&#x57FA;&#x56E0;&#x578B;&#x547C;&#x5401;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x7684;&#x5916;&#x663E;&#x5B50;&#x7A7A;&#x95F4;&#x7684; 89%&#x3002;

&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x4E0E;&#x5927;&#x89C4;&#x6A21;&#x5E76;&#x884C;&#x76EE;&#x6807;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x7684;&#x8D85;&#x957F;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x6742;&#x4EA4;&#x9009;&#x62E9;&#x3002;

Targeting genomic loci by massively parallel sequencing requires new methods to enrich templates to be sequenced. We developed a capture method that uses biotinylated RNA 'baits' to fish targets out of a 'pond' of DNA fragments. The RNA is transcribed from PCR-amplified oligodeoxynucleotides originally synthesized on a microarray, generating sufficient bait for multiple captures at concentrations high enough to drive the hybridization. We tested this method with 170-mer baits that target >15,000 coding exons (2.5 Mb) and four regions (1.7 Mb total) using Illumina sequencing as read-out. About 90% of uniquely aligning bases fell on or near bait sequence; up to 50% lay on exons proper. The uniformity was such that approximately 60% of target bases in the exonic 'catch', and approximately 80% in the regional catch, had at least half the mean coverage. One lane of Illumina sequence was sufficient to call high-confidence genotypes for 89% of the targeted exon space.

Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing.

Ciblage loci g&#xE9;nomiques par s&#xE9;quen&#xE7;age massivement parall&#xE8;le exige de nouvelles m&#xE9;thodes pour enrichir les mod&#xE8;les &#xE0; &#xEA;tre s&#xE9;quenc&#xE9;. Nous avons d&#xE9;velopp&#xE9; une m&#xE9;thode de capture qui utilise biotinyl&#xE9;s &#x26;#39;app&#xE2;ts pour p&#xEA;cher des ARN cibles hors d&#x26;#39;un &#xAB;bassin&#xBB; de fragments d&#x26;#39;ADN. L&#x26;#39;ARN est transcrit &#xE0; partir amplifi&#xE9;s par PCR &#xE0; l&#x26;#39;origine oligod&#xE9;soxynucl&#xE9;otides de synth&#xE8;se sur un micror&#xE9;seau, la g&#xE9;n&#xE9;ration d&#x26;#39;app&#xE2;t suffisant pour plusieurs captures &#xE0; des concentrations suffisamment &#xE9;lev&#xE9;es pour entra&#xEE;ner l&#x26;#39;hybridation. Nous avons test&#xE9; cette m&#xE9;thode avec 170 app&#xE2;ts-mer qui cible&#x26;gt; 15.000 exons codant (2,5 Mb) et quatre r&#xE9;gions (1,7 Mo au total) en utilisant le s&#xE9;quen&#xE7;age Illumina comme lecture. Environ 90% des bases uniquement alignement est tomb&#xE9; sur ou &#xE0; proximit&#xE9; s&#xE9;quence app&#xE2;t; jusqu&#x26;#39;&#xE0; 50% de ponte sur les exons appropri&#xE9;s. L&#x26;#39;uniformit&#xE9; est telle qu&#x26;#39;environ 60% des bases de cibles dans le exonique &#xAB;catch&#xBB;, et environ 80% dans les captures r&#xE9;gionales, ont eu au moins la moiti&#xE9; de la couverture moyenne. Une voie de la s&#xE9;quence d&#x26;#39;Illumina est suffisante pour appeler &#xE0; haute confiance g&#xE9;notypes pour 89% de l&#x26;#39;espace exon cibl&#xE9;.

S&#xE9;lection solution hybride avec Ultra-longues oligonucl&#xE9;otides pour le s&#xE9;quen&#xE7;age massivement parall&#xE8;le cibl&#xE9;e

Massiv-parallelen Sequenzierung genomischer Loci Targeting erfordert neue Methoden, um Vorlagen zu sequenziert werden zu bereichern. Wir entwickelten ein Capture-Methode, die biotinylierten RNA verwendet &#39;K&ouml;der&#39; Fisch Zielen aus einer &#39;Teich&#39; DNA-Fragmente. Die RNA ist von PCR-verst&auml;rkten Oligodeoxynucleotides, die urspr&uuml;nglich auf einem Microarray synthetisiert transkribiert erzeugen ausreichend K&ouml;der f&uuml;r mehrere Aufnahmen in Konzentrationen, die hoch genug ist, um die Hybridisierung zu fahren. Wir testeten diese Methode mit 170-Mer K&ouml;der, die auf &gt; 15.000 Kodierung Exons (2,5 Mb) und vier Regionen (1.7 Mb gesamt) mit Illumina Sequenzierung als auslesen. Etwa 90 % der eindeutig ausrichten Basen fiel auf oder nahe K&ouml;der-Sequenz; bis zu 50 % lag auf ordnungsgem&auml;&szlig;e Exons. Die Einheitlichkeit war so, dass etwa 60 % der Ziel-Basen in &#39;fangen die exonic&#39; und ca. 80 % in der regionalen Fang, mindestens die H&auml;lfte die mittlere Abdeckung hatte. Eine Fahrspur Illumina Sequenz war ausreichend hoch-Vertrauen-Genotypen f&uuml;r 89 % des Raumes gezielt Exon aufrufen.

L&ouml;sung-Hybrid-Auswahl mit ultralangen Oligonukleotide f&uuml;r massiv parallele gezielte Sequenzierung.

Targeting loci genomici sequenziamento parallelismo massivo richiede nuovi metodi per arricchire i modelli ad essere sequenziato. Abbiamo sviluppato un metodo di cattura che utilizza biotinilato RNA &#39;esche&#39; per obiettivi di pesce fuori di un &#39;laghetto&#39; di frammenti di DNA. il RNA &egrave; trascritto da oligodeoxynucleotides PCR amplificati originariamente sintetizzato su un microarray, generando esca sufficiente per catture multiple a concentrazioni abbastanza alte per guidare l&#39;ibridazione. Abbiamo testato questo metodo con esche 170-mer che destinazione &amp;gt; 15.000 codifica esoni (2,5 Mb) e quattro regioni (1,7 Mb in totale) mediante sequenziamento Illumina come read-out. Circa il 90% di allineare in modo univoco basi cadde su o vicino a sequenza esca; fino al 50% laici su esoni corretto. L&#39;uniformit&agrave; fu tale che circa il 60% delle basi di destinazione nell&#39;esonico &#39;catch&#39; e circa l&#39;80% in catture regionale, ha avuto almeno la met&agrave; la copertura Media. Una corsia della sequenza Illumina era sufficiente chiamare confidenza elevata genotipi per 89% dello spazio esone mirati.

Selezione di soluzione ibrida con oligonucleotidi lunghissima per massively parallel sequenziazione mirata.

&#x8D85;&#x4E26;&#x5217;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x306B;&#x3088;&#x308A;&#x3001;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x5EA7;&#x3092;&#x6A19;&#x7684;&#x3068;&#x3059;&#x308B;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x304C;&#x914D;&#x5217;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x30C6;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x3092;&#x8C4A;&#x304B;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x5FC5;&#x8981;&#x304C;&#x3042;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x3001;DNA&#x65AD;&#x7247;&#x306E; &#x26;quot;&#x6C60;&#x26;quot;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x91E3;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306B;&#x30D3;&#x30AA;&#x30C1;&#x30F3;&#x5316;RNA &#x26;#39;&#x990C;&#x26;#39;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30C1;&#x30E3;&#x3059;&#x308B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3092;&#x958B;&#x767A;&#x3057;&#x305F;&#x3002; RNA&#x306F;&#x3001;&#x3082;&#x3068;&#x3082;&#x3068;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C0;&#x30A4;&#x30BC;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3092;&#x99C6;&#x52D5;&#x3059;&#x308B;&#x306E;&#x306B;&#x5341;&#x5206;&#x306A;&#x9AD8;&#x6FC3;&#x5EA6;&#x3067;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30C1;&#x30E3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5341;&#x5206;&#x306A;&#x990C;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x3001;&#x30DE;&#x30A4;&#x30AF;&#x30ED;&#x30A2;&#x30EC;&#x30A4;&#x4E0A;&#x306B;&#x5408;&#x6210;&#x3055;&#x308C;&#x305F;PCR&#x5897;&#x5E45;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x304B;&#x3089;&#x8EE2;&#x5199;&#x3055;&#x308C;&#x308B;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x76EE;&#x6A19;&#x26;gt; 15,000&#x30B3;&#x30FC;&#x30C7;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x30A8;&#x30AF;&#x30BD;&#x30F3;&#xFF08;2.5 MB&#xFF09;&#x3068;&#x8AAD;&#x307F;&#x51FA;&#x3057;&#x3068;&#x30A4;&#x30EB;&#x30DF;&#x30CA;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;4&#x3064;&#x306E;&#x5730;&#x57DF;&#xFF08;&#x5408;&#x8A08;1.7 MB&#xFF09;&#x306F;170-mer&#x306E;&#x990C;&#x3067;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x3092;&#x30C6;&#x30B9;&#x30C8;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4E00;&#x610F;&#x306B;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3066;&#x57FA;&#x5730;&#x306E;&#x7D04;90&#xFF05;&#x304C;&#x990C;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;&#x4E0A;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x8FD1;&#x304F;&#x306B;&#x843D;&#x3061;&#x3001;50&#xFF05;&#x307E;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x9069;&#x5207;&#x306A;&#x30A8;&#x30AF;&#x30BD;&#x30F3;&#x306B;&#x6A2A;&#x305F;&#x308F;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x305F;&#x3002;&#x5747;&#x4E00;&#x6027;&#x306F;&#x30A8;&#x30AF;&#x30BD;&#x30F3; &#x26;quot;&#x30AD;&#x30E3;&#x30C3;&#x30C1;&#x26;quot;&#x306E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x57FA;&#x5730;&#x306E;&#x7D04;60&#xFF05;&#x3001;&#x5730;&#x57DF;&#x306E;&#x6F01;&#x7372;&#x91CF;&#x306E;&#x7D04;80&#xFF05;&#x304C;&#x3001;&#x5C11;&#x306A;&#x304F;&#x3068;&#x3082;&#x534A;&#x5206;&#x306E;&#x5E73;&#x5747;&#x30AB;&#x30D0;&#x30EC;&#x30C3;&#x30B8;&#x3092;&#x6301;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306A;&#x3082;&#x306E;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;&#x30A4;&#x30EB;&#x30DF;&#x30CA;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;1&#x30EC;&#x30FC;&#x30F3;&#x306F;&#x3001;&#x6A19;&#x7684;&#x30A8;&#x30AF;&#x30BD;&#x30F3;&#x9818;&#x57DF;&#x306E;89&#xFF05;&#x9AD8;&#x306E;&#x4FE1;&#x983C;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x3092;&#x547C;&#x3073;&#x51FA;&#x3059;&#x306E;&#x306B;&#x5341;&#x5206;&#x3067;&#x3042;&#x3063;&#x305F;&#x3002;

&#x8D85;&#x4E26;&#x5217;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x8D85;&#x9577;&#x3044;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x3092;&#x200B;&#x200B;&#x6709;&#x3059;&#x308B;&#x6EB6;&#x6DB2;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x9078;&#x629E;

&#xB300;&#xADDC;&#xBAA8; &#xBCD1;&#xB82C; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1; &#xD558; &#xC5EC; &#xAC8C;&#xB188; loci&#xB97C; &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1; &#xD560; &#xD15C;&#xD50C;&#xB9BF;&#xC744; &#xD48D;&#xBD80; &#xD558; &#xAC8C; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC29;&#xBC95;&#xC774; &#xD544;&#xC694; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; DNA &#xC870;&#xAC01;&#xC758; &#39;&#xC5F0;&#xBABB;&#39;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0DD;&#xC120; &#xBAA9;&#xD45C;&#xB97C; &#39; &#xBBF8;&#xB07C;&#39; biotinylated RNA&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xCEA1;&#xCC98; &#xBC29;&#xBC95; &#xAC1C;&#xBC1C;. RNA&#xB294; PCR &#xC99D;&#xD3ED; oligodeoxynucleotides &#xC6D0;&#xB798;&#xB294; microarray&#xC5D0; &#xD569;&#xC131;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCF5;&#xC0AC;&#xD560; &#xC218; &#xB4DC;&#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB97C; &#xAD50; &#xC7A1; &#xB9CC;&#xD07C; &#xB192;&#xC740; &#xB18D;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC5EC;&#xB7EC; &#xAC1C;&#xC758; &#xCEA1;&#xCC98;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xCDA9;&#xBD84; &#xD55C; &#xBBF8;&#xB07C;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131;. &#xB300;&#xC0C1;&#xC73C;&#xB85C; &#xD558;&#xB294; 170-&#xBA54; &#xB974; baits&#xC774;&#xC774; &#xBC29;&#xBC95; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8; &amp;gt; 15000 exons (2.5 m b) &#xBC0F; 4 &#xAC1C; &#xC601;&#xC5ED; (&#xCD1D; 1.7 Mb) &#xC77D;&#xAE30;&#xB85C; Illumina&#xC758; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xCF54;&#xB529;. &#xACE0;&#xC720; &#xD558; &#xAC8C; &#xC815;&#xB82C; &#xAE30;&#xC9C0;&#xC758; &#xC57D; 90% &#xB5A8;&#xC5B4;&#xC9C4; &#xB610;&#xB294; &#xADFC;&#xCC98;&#xC5D0; &#xBBF8;&#xB07C; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;; &#xCD5C;&#xB300; 50 %exons &#xC801;&#xC808; &#xD55C;&#xC5D0; &#xB204;&#xC6CC;. &#xADE0;&#xC77C;&#xC131;&#xC740; &#xADF8;&#xB7F0; &#xB300;&#xC0C1; &#xAE30;&#xC9C0;&#xB294; exonic &#39;catch&#39;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xC9C0;&#xC5ED; catch&#xC5D0;&#xC11C; &#xC57D; 80%&#xC758; &#xC57D; 60%&#xB294; &#xC801;&#xC5B4;&#xB3C4; &#xC808;&#xBC18; &#xB9D0;&#xC740; &#xCDE8;&#xC7AC;&#xB97C; &#xD588;&#xB2E4;. Illumina &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xC758; &#xD55C; &#xCC28;&#xC120; 89%&#xC758; &#xB300;&#xC0C1;&#xB41C; exon &#xACF5;&#xAC04;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xB192;&#xC740; &#xC2E0;&#xB8B0; genotypes&#xC744; &#xD638;&#xCD9C; &#xD558;&#xB294; &#xB370; &#xCDA9;&#xBD84; &#xD588;&#xB2E4;.

&#xB300;&#xADDC;&#xBAA8; &#xBCD1;&#xB82C; &#xD0C0;&#xAC9F;&#xB41C; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; ultra-long oligonucleotides&#xC640; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158; &#xD558;&#xC774;&#xBE0C;&#xB9AC;&#xB4DC; &#xC120;&#xD0DD;.

Orientaci&#xF3;n loci del genoma por la secuenciaci&#xF3;n masiva en paralelo requiere nuevos m&#xE9;todos para enriquecer las plantillas para ser secuenciados. Hemos desarrollado un m&#xE9;todo de captura que utiliza biotina ARN &#x26;#39;cebos para pescar de los objetivos de una&#x26;#39; laguna &#x26;#39;de fragmentos de ADN. El ARN se transcribe a partir de la PCR-amplificaci&#xF3;n oligodesoxinucle&#xF3;tidos inicialmente sintetizados en un microarray, generando cebo suficiente para m&#xFA;ltiples capturas en concentraciones lo suficientemente altas como para conducir la hibridaci&#xF3;n. Hemos probado este m&#xE9;todo con 170-mer cebos que se dirigen a los exones de codificaci&#xF3;n de 15.000 (2,5 Mb) y cuatro regiones (1,7 MB en total) utilizando la secuenciaci&#xF3;n de Illumina, como lectura. Alrededor del 90% de las bases &#xFA;nica alineaci&#xF3;n cay&#xF3; en o cerca de la secuencia de cebo, hasta un 50% estaba en los exones correspondientes. La uniformidad es tal que aproximadamente el 60% de las bases de destino en el exonic &#x26;#39;captura&#x26;#39;, y aproximadamente el 80% de la captura regional, tuvo al menos la mitad de la cobertura media. Uno de los carriles de la secuencia de Illumina fue suficiente para llamar a los genotipos de alta confianza del 89% del espacio de ex&#xF3;n.

Soluci&#xF3;n h&#xED;brida de selecci&#xF3;n con ultra-largas oligonucle&#xF3;tidos para la secuenciaci&#xF3;n masiva en paralelo dirigida

Gezielte RNA-Seq verbindet Sequenzierung der n&auml;chsten Generation mit Einnahme von Sequenzen aus einer relevanten Teilmenge von einer Transkriptom. Bei Tests durch die Erfassung von Sequenzen aus einer Tumor-cDNA-Bibliothek durch Hybridation zu Oligonukleotid f&uuml;r 467 Krebs-in Verbindung stehenden Gene spezifische Tastk&ouml;pfe, diese Methode zeigte hohen Selektivit&auml;t verbessert Mutation-Erkennung aktivieren Entdeckung von Roman Chim&auml;rer Mitschriften und RNA Ausdruck Daten bereitgestellt. Gezielte RNA-Seq erzeugt so einen erweiterten Blick auf den molekularen Zustand aus einer Reihe von &quot;hohe Zinsen&quot; Gene.

Gezielte n&auml;chsten Generation Sequenzierung von einem Krebs Transkriptom verbessert die Erkennung von Sequenz-Varianten und neuartige Verschmelzung Abschriften.

RNA-Seq mirati combina sequenziamento di prossima generazione con acquisizione di sequenze da un sottoinsieme di un transcriptome pertinente. Quando il test per l&#39;acquisizione di sequenze da una libreria di cDNA del tumore tramite l&#39;ibridazione di oligonucleotide sonde specifiche per 467 geni legati al cancro, questo metodo ha mostrato elevata selettivit&agrave;, migliorata la rilevazione di mutazione che permette la scoperta del romanzo trascritti chimerici e ha fornito dati di espressione di RNA. Cos&igrave;, mirati RNA-Seq produce una visualizzazione avanzata dello stato molecolare di un set di geni &quot;grande interesse&quot;.

Mirati sequenziamento next-generation del transcriptome cancro migliora la rilevazione di varianti di sequenza e trascrizioni di fusione romanzo.

&#x5BFE;&#x8C61;&#x3068;&#x306A;&#x308B; RNA Seq &#x6B21;&#x4E16;&#x4EE3;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x3001;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x95A2;&#x9023;&#x3059;&#x308B;&#x30B5;&#x30D6;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x304B;&#x3089;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30C1;&#x30E3;&#x3068;&#x3092;&#x517C;&#x306D;&#x5099;&#x3048;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x30AA;&#x30EA;&#x30B4;&#x30CC;&#x30AF;&#x30EC;&#x30AA;&#x30C1;&#x30C9;&#x306E;&#x4EA4;&#x914D;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x816B;&#x760D; cDNA &#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x30FC;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x3092;&#x30AD;&#x30E3;&#x30D7;&#x30C1;&#x30E3; &#x30C6;&#x30B9;&#x30C8; 467 &#x304C;&#x3093;&#x95A2;&#x9023;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x7279;&#x7570;&#x7684;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30D6;&#x3057;&#x306F;&#x3001;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306F;&#x9AD8;&#x3044;&#x9078;&#x629E;&#x6027;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x305F;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x30AD;&#x30E1;&#x30E9;&#x8EE2;&#x5199;&#x7269;&#x306E;&#x767A;&#x898B;&#x3092;&#x6709;&#x52B9;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x7A81;&#x7136;&#x5909;&#x7570;&#x691C;&#x51FA;&#x3092;&#x6539;&#x5584;&#x3057;&#x3001;RNA &#x767A;&#x73FE;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3092;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3057;&#x305F;&#x304C;&#x3063;&#x3066;&#x3001;&#x5BFE;&#x8C61;&#x3068;&#x306A;&#x308B; RNA Seq &#x306F;&#x7D44;&#x306E;&#x300C;&#x9AD8;&#x91D1;&#x5229;&#x300D;&#x907A;&#x4F1D;&#x5B50;&#x306E;&#x5206;&#x5B50;&#x72B6;&#x614B;&#x306E;&#x5F37;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x30D3;&#x30E5;&#x30FC;&#x3092;&#x751F;&#x6210;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x5BFE;&#x8C61;&#x3068;&#x306A;&#x308B;&#x6B21;&#x4E16;&#x4EE3;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x304C;&#x3093;&#x30C8;&#x30E9;&#x30F3;&#x30B9;&#x30AF;&#x30EA;&#x30D7;&#x30C8;&#x30FC;&#x30E0;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306E;&#x4E9C;&#x7A2E;&#x3068;&#x65B0;&#x898F;&#x878D;&#x5408;&#x8EE2;&#x5199;&#x7523;&#x7269;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x304C;&#x5411;&#x4E0A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x7684; RNA Seq &#x7ED3;&#x5408;&#x4E0B;&#x4E00;&#x4EE3;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x4E0E;&#x5E8F;&#x5217;&#x4ECE;&#x5B50;&#x96C6;&#x76F8;&#x5173;&#x7684;&#x8F6C;&#x5F55;&#x7EC4;&#x7684;&#x6355;&#x83B7;&#x3002;&#x6D4B;&#x8BD5;&#x901A;&#x8FC7;&#x6355;&#x83B7;&#x80BF;&#x7624; cDNA &#x6587;&#x5E93;&#x5E8F;&#x5217;&#x7684;&#x5BE1;&#x6838;&#x82F7;&#x9178;&#x6742;&#x4EA4;&#x63A2;&#x9488;&#x5177;&#x4F53;&#x4E3A; 467 &#x4E0E;&#x764C;&#x75C7;&#x6709;&#x5173;&#x7684;&#x57FA;&#x56E0;&#xFF0C;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x663E;&#x793A;&#x9AD8;&#x9009;&#x62E9;&#x6027;&#x3001; &#x6539;&#x8FDB;&#x542F;&#x7528;&#x65B0;&#x578B;&#x5D4C;&#x5408;&#x7684;&#x8A8A;&#x672C;&#xFF0C;&#x53D1;&#x73B0;&#x7684;&#x7A81;&#x53D8;&#x68C0;&#x6D4B;&#x548C;&#x63D0;&#x4F9B; RNA &#x8868;&#x8FBE;&#x6570;&#x636E;&#x3002;&#x56E0;&#x6B64;&#xFF0C;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x7684; RNA Seq &#x4EA7;&#x751F;&#x7684;&quot;&#x9AD8;&#x5229;&#x606F;&quot;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x7684;&#x5206;&#x5B50;&#x72B6;&#x6001;&#x589E;&#x5F3A;&#x7684;&#x89C6;&#x56FE;&#x3002;

&#x764C;&#x75C7;&#x8F6C;&#x5F55;&#x7EC4;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x4E0B;&#x4E00;&#x4EE3;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x5730;&#x63D0;&#x9AD8;&#x4E86;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x5E8F;&#x5217;&#x53D8;&#x5F02;&#x548C;&#x65B0;&#x578B;&#x878D;&#x5408;&#x6210;&#x7EE9;&#x5355;&#x3002;

Targeted RNA-Seq combines next-generation sequencing with capture of sequences from a relevant subset of a transcriptome. When testing by capturing sequences from a tumor cDNA library by hybridization to oligonucleotide probes specific for 467 cancer-related genes, this method showed high selectivity, improved mutation detection enabling discovery of novel chimeric transcripts, and provided RNA expression data. Thus, targeted RNA-Seq produces an enhanced view of the molecular state of a set of "high interest" genes.

Targeted next-generation sequencing of a cancer transcriptome enhances detection of sequence variants and novel fusion transcripts.

RNA-Seq cibl&eacute;e combine s&eacute;quen&ccedil;age nouvelle g&eacute;n&eacute;ration avec la capture des s&eacute;quences d&#39;un sous-ensemble pertinent d&#39;un transcriptome. Lors de l&#39;essai de capturer des s&eacute;quences d&#39;une ADNc de tumeur par hybridation d&#39;oligonucl&eacute;otide sondes sp&eacute;cifiques pour 467 g&egrave;nes li&eacute;s au cancer, cette m&eacute;thode a montr&eacute; une s&eacute;lectivit&eacute; &eacute;lev&eacute;e, une meilleure d&eacute;tection de mutations permettant la d&eacute;couverte de nouvelles transcriptions chim&eacute;riques et fourni les donn&eacute;es d&#39;expression ARN. Ainsi, RNA-Seq cibl&eacute;e produit une vue am&eacute;lior&eacute;e de l&#39;&eacute;tat mol&eacute;culaire d&#39;un ensemble de g&egrave;nes de &laquo; haut int&eacute;r&ecirc;t &raquo;.

S&eacute;quen&ccedil;age de g&eacute;n&eacute;ration cibl&eacute; d&#39;un transcriptome du cancer am&eacute;liore la d&eacute;tection des variantes de s&eacute;quence et de transcriptions de fusion roman.

&#xD0C0;&#xAC9F;&#xB41C; RNA Seq &#xCEA1;&#xCC98; &#xAD00;&#xB828; &#xC77C;&#xBD80;&#xB294; transcriptome&#xC758; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xC758; &#xB2E4;&#xC74C;-&#xC138;&#xB300; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1;&#xC744; &#xACB0;&#xD569;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. 467 &#xC554; &#xAD00;&#xB828; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD2B9;&#xC815; &#xD504;&#xB85C;&#xBE0C; oligonucleotide &#xAD50; &#xC7A1; &#xD558; &#xC5EC; &#xC885;&#xC591; cDNA &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4;&#xB97C; &#xD3EC;&#xCC29; &#xD558; &#xC5EC; &#xD14C;&#xC2A4;&#xD2B8;&#xB97C; &#xD558;&#xB294; &#xACBD;&#xC6B0;&#xC774; &#xBA54;&#xC11C;&#xB4DC; &#xB192;&#xC740; &#xC120;&#xD0DD;&#xB3C4; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xB3CC;&#xC5F0;&#xBCC0;&#xC774; &#xAC80;&#xCD9C; &#xC18C;&#xC124; chimeric &#xC131;&#xC801;&#xD45C;&#xC758; &#xAC80;&#xC0C9; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xC744; &#xAC1C;&#xC120; &#xD558; &#xACE0; RNA &#xC2DD; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC81C;&#xACF5;. &#xB530;&#xB77C;&#xC11C;, &#xB300;&#xC0C1;&#xB41C; RNA Seq &#xC9D1;&#xD569; &quot;&#xB192;&#xC740; &#xC774;&#xC790;&quot; &#xC720;&#xC804;&#xC790;&#xC758; &#xBD84;&#xC790; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xC758; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xB41C; &#xBCF4;&#xAE30;&#xB97C; &#xC0DD;&#xC131;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC554; transcriptome&#xC758; &#xD45C;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; &#xD55C; &#xCC28;&#xC138;&#xB300; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2A4; &#xBCC0;&#xC885;&#xACFC; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xD4E8;&#xC804; &#xC131;&#xC801;&#xD45C;&#xC758; &#xD0D0;&#xC9C0;&#xB97C; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xC2DC;&#xD0B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Los RNA-Seq combina secuenciaci&oacute;n de nueva generaci&oacute;n con la captura de secuencias de un subconjunto relevante de un transcriptoma. Cuando prueba por capturar secuencias de una biblioteca de cDNA de tumor por hibridaci&oacute;n de oligonucle&oacute;tidos sondas espec&iacute;ficas para 467 genes relacionados con el c&aacute;ncer, este m&eacute;todo demostr&oacute; alta selectividad, mejor&oacute; la detecci&oacute;n de la mutaci&oacute;n que permite el descubrimiento de novela transcripciones quim&eacute;ricas y proporcionaron datos de expresi&oacute;n de RNA. As&iacute;, los RNA-Seq produce una vista mejorada del estado molecular de un conjunto de genes de &quot;gran inter&eacute;s&quot;.

Dirigida la secuencia next-generation de un c&aacute;ncer transcriptoma mejora la detecci&oacute;n de variantes de la secuencia y transcripciones de la fusi&oacute;n de novela.

&#x6B64;&#x5355;&#x5143;&#x63CF;&#x8FF0;&#x4E3A;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x5730;&#x4ECE;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x4E2D;&#x6DF7;&#x5408;&#x9009;&#x62E9;&#x65B9;&#x6CD5;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x7167;&#x6392;&#x80F6;&#x7247;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x5206;&#x6790;&#x4EEA;&#x7B2C;&#x4E8C;&#x987A;&#x5E8F;&#x7684;&#x968F;&#x673A;&#x526A;&#x5207;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4; DNA &#x5E93;&#x7528;&#x4E30;&#x5BCC;&#x7684;&#x534F;&#x8BAE;&#x3002;&#x6839;&#x636E;&#x6267;&#x884C;&#x7684;&#x5236;&#x5907;&#x4E0E;&#x7167;&#x6392;&#x80F6;&#x7247;&#x914D;&#x5BF9;&#x7AEF;&#x5E93;&#x6DF7;&#x5408;&#x9009;&#x62E9;&#x7684;&#x5173;&#x952E;&#x6B65;&#x9AA4;&#x662F;&#xFF0C;&#x8BBE;&#x8BA1;&#x548C;&#x8BA2;&#x8D2D;&#x6DF7;&#x5408;&#x9009;&#x62E9;&#x4F4E;&#x805A;&#x6C60;&#x7684;&#x6B65;&#x9AA4;&#x8FDB;&#x884C;&#x5BA1;&#x6838;&#x3002;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x4E34;&#x754C;&#x53C2;&#x6570;&#x3001; &#x6027;&#x80FD;&#x6307;&#x6807;&#x548C;&#x5206;&#x6790;&#x5DE5;&#x4F5C;&#x6D41;&#x3002;

&#x6309;&#x9009;&#x5B9A;&#x5185;&#x5BB9;&#x7B5B;&#x9009;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x4E2D;&#x6DF7;&#x5408;&#x7684;&#x6709;&#x9488;&#x5BF9;&#x6027;&#x7684;&#x5916;&#x663E;&#x5B50;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x3002;

This unit describes a protocol for the targeted enrichment of exons from randomly sheared genomic DNA libraries using an in-solution hybrid selection approach for sequencing on an Illumina Genome Analyzer II. The steps for designing and ordering a hybrid selection oligo pool are reviewed, as are critical steps for performing the preparation and hybrid selection of an Illumina paired-end library. Critical parameters, performance metrics, and analysis workflow are discussed.

Targeted exon sequencing by in-solution hybrid selection.

Cette unit&eacute; d&eacute;crit un protocole pour l&#39;enrichissement cibl&eacute;e des exons de biblioth&egrave;ques d&#39;ADN g&eacute;nomiques cisaill&eacute;s au hasard en utilisant une approche de s&eacute;lection dans la solution hybride pour le s&eacute;quen&ccedil;age sur une Illumina Genome Analyzer II. Les &eacute;tapes de conception et commande un bassin d&#39;oligo de s&eacute;lection hybride sont l&#39;objet, comme sont des &eacute;tapes essentielles pour effectuer la pr&eacute;paration et la s&eacute;lection hybride d&#39;une biblioth&egrave;que de bout jumel&eacute; Illumina. On discute des param&egrave;tres critiques, mesures de performances et flux de travail de l&#39;analyse.

S&eacute;quen&ccedil;age exon cibl&eacute;s par s&eacute;lection dans la solution hybride.

Diese Ma&szlig;einheit beschreibt ein Protokoll f&uuml;r die gezielte Anreicherung des Exons von zuf&auml;llig sheared genomische DNA-Bibliotheken, die mit einer Auswahl in L&ouml;sung Hybridansatz f&uuml;r Sequenzierung auf einem Illumina Genome Analyzer II. Die Schritte f&uuml;r das Entwerfen und bestellen einen Hybrid-Auswahl-Oligo-Pool werden &uuml;berpr&uuml;ft, wie kritische Schritt f&uuml;r Schritt der Vorbereitung und Hybrid-Auswahl einer Illumina gepaart-End-Bibliothek sind. Kritische Parameter, Performance-Kennzahlen und Analyse-Workflow werden diskutiert.

Exon-Sequenzierung von in-L&ouml;sung-Hybrid-Auswahl ausgerichtet.

Questa unit&agrave; descrive un protocollo per l&#39;arricchimento mirato degli esoni da librerie di DNA genomic casualmente tosate utilizzando un approccio di selezione in soluzione ibrida per il sequenziamento su un&#39;Illumina Genome Analyzer II. I passaggi per la progettazione e ordinazione di un pool di oligo selezione ibrido sono rivisti, come sono le fasi critiche per eseguire la preparazione e la selezione di ibridi di una libreria di coppia-fine Illumina. I parametri critici, metriche di performance e workflow di analisi sono discussi.

Mirate esone sequenziamento di selezione in soluzione ibrida.

&#x3053;&#x306E;&#x30E6;&#x30CB;&#x30C3;&#x30C8;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x7D5E;&#x3063;&#x305F;&#x6FC3;&#x7E2E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9; &#x30A4;&#x30EB;&#x30DF;&#x30CA; &#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x306E;&#x30A2;&#x30CA;&#x30E9;&#x30A4;&#x30B6;&#x30FC; ii &#x7528;&#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x9078;&#x629E;&#x624B;&#x6CD5;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x30E9;&#x30F3;&#x30C0;&#x30E0;&#x306B;&#x305B;&#x3093;&#x65AD;&#x306E; genomic DNA &#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x30A8;&#x30AF;&#x30BD;&#x30F3;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6E96;&#x5099;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x9078;&#x629E;&#x30A4;&#x30EB;&#x30DF;&#x30CA; &#x30DA;&#x30A2;&#x30A8;&#x30F3;&#x30C9; &#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x30E9;&#x30EA;&#x3092;&#x5B9F;&#x884C;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30B9;&#x30C6;&#x30C3;&#x30D7;&#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x8A2D;&#x8A08;&#x3057;&#x3001;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x9078;&#x629E; oligo &#x30D7;&#x30FC;&#x30EB;&#x3054;&#x6CE8;&#x6587;&#x624B;&#x9806;&#x304C;&#x5BE9;&#x67FB;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x91CD;&#x8981;&#x306A;&#x30D1;&#x30E9;&#x30E1;&#x30FC;&#x30BF;&#x30FC;&#x3001;&#x30D1;&#x30D5;&#x30A9;&#x30FC;&#x30DE;&#x30F3;&#x30B9; &#x30E1;&#x30C8;&#x30EA;&#x30AF;&#x30B9;&#x3001;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x89E3;&#x6790;&#x306E;&#x30EF;&#x30FC;&#x30AF;&#x30D5;&#x30ED;&#x30FC;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x30A8;&#x30AF;&#x30BD;&#x30F3; &#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x3067;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x9078;&#x629E;&#x30BF;&#x30FC;&#x30B2;&#x30C3;&#x30C8;&#x3002;

&#xC774; &#xB2E8;&#xC704; exons Illumina &#xAC8C;&#xB188; &#xBD84;&#xC11D;&#xAE30; II&#xC5D0; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD558;&#xC774;&#xBE0C;&#xB9AC;&#xB4DC; &#xC120;&#xD0DD; &#xC811;&#xADFC;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC784;&#xC758;&#xB85C; &#xB5BC;&#xC5B4; genomic DNA &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB300;&#xC0C1;&#xB41C; &#xB18D;&#xCD95;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC900;&#xBE44; &#xBC0F; Illumina &#xC9DD; &#xC5D4;&#xB4DC; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C;&#xB7EC;&#xB9AC;&#xC758; &#xD558;&#xC774;&#xBE0C;&#xB9AC;&#xB4DC; &#xC120;&#xD0DD;&#xC744; &#xC218;&#xD589; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB2E8;&#xACC4;&#xB294; &#xC124;&#xACC4; &#xBC0F; &#xD558;&#xC774;&#xBE0C;&#xB9AC;&#xB4DC; &#xC120;&#xD0DD; &#xC62C;&#xB9AC;&#xACE0; &#xD480;&#xC744; &#xC8FC;&#xBB38; &#xD558;&#xB294; &#xB2E8;&#xACC4; &#xAC80;&#xD1A0; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC911;&#xC694; &#xD55C; &#xB9E4;&#xAC1C; &#xBCC0;&#xC218;, &#xC131;&#xB2A5; &#xBA54;&#xD2B8;&#xB9AD; &#xBC0F; &#xBD84;&#xC11D; &#xC6CC;&#xD06C;&#xD50C;&#xB85C; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC194;&#xB8E8;&#xC158;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD558;&#xC774;&#xBE0C;&#xB9AC;&#xB4DC; &#xC120;&#xD0DD;&#xC744; &#xC5D1;&#xC190; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1;&#xC758; &#xB300;&#xC0C1;.

Esta unidad describe un protocolo para el enriquecimiento espec&iacute;fico de exones de bibliotecas de ADN gen&oacute;micos esquilados al azar utilizando un enfoque de selecci&oacute;n en soluci&oacute;n h&iacute;brida para la secuenciaci&oacute;n de un genoma de Illumina Analyzer II. Se repasan los pasos para dise&ntilde;ar y ordenar un grupo de oligo selecci&oacute;n de h&iacute;bridos, como son pasos cr&iacute;ticos para llevar a cabo la preparaci&oacute;n y selecci&oacute;n de h&iacute;bridos de una biblioteca de emparejado-end Illumina. Se discuten los par&aacute;metros cr&iacute;ticos, m&eacute;tricas de desempe&ntilde;o y flujo de trabajo de an&aacute;lisis.

Concentrado en la secuencia del ex&oacute;n por selecci&oacute;n en soluci&oacute;n h&iacute;brida.

&#x6211;&#x4EEC;&#x5DF2;&#x7ECF;&#x9002;&#x5E94;&#x89E3;&#x51B3;&#x65B9;&#x6848;&#x6DF7;&#x5408;&#x9009;&#x62E9;&#x534F;&#x8BAE;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x4E30;&#x5BCC;&#x4EE5;&#x4EBA;&#x7C7B;&#x9057;&#x4F20;&#x6750;&#x6599;&#x4E3A;&#x4E3B;&#x7684;&#x4E34;&#x5E8A;&#x6837;&#x672C;&#x4E2D;&#x7684; DNA &#x75C5;&#x539F;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4F7F;&#x7528;&#x6A21;&#x62DF;&#x6DF7;&#x5408;&#x7269;&#x7684;&#x4EBA;&#x6743;&#x548C;&#x6076;&#x6027;&#x759F;&#x75BE;&#x759F;&#x539F;&#x866B; DNA&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x4ECE;&#x53D7;&#x611F;&#x67D3;&#x75C5;&#x4EBA;&#x7684;&#x4E34;&#x5E8A;&#x6837;&#x672C;&#xFF0C;&#x8BC1;&#x660E;&#x5927;&#x7EA6; 40-fold &#x5BCC;&#x96C6;&#x7684;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B; DNA &#x6742;&#x4EA4;&#x9009;&#x62E9;&#x540E;&#x5E73;&#x5747;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x65B9;&#x6CD5;&#x5C06;&#x4F7F;&#x9AD8;&#x6548;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x7684;&#x75C5;&#x539F;&#x4F53;&#x4ECE;&#x4E34;&#x5E8A;&#x6837;&#x672C;&#xFF0C;&#x4EE5;&#x53CA;&#x591A;&#x6837;&#x7684;&#x540E;&#x751F;&#x95E8;&#x5185;&#x751F;&#x6D3B;&#x7684; endosymbiotic &#x751F;&#x7269;&#x5982;&#x514B;&#x6C0F;&#x7684;&#x5148;&#x540E;&#x987A;&#x5E8F;&#x3002;

&#x6DF7;&#x5408;&#x9009;&#x62E9;&#x4E34;&#x5E8A;&#x6807;&#x672C;&#x4E2D;&#x63D0;&#x53D6;&#x75C5;&#x539F;&#x4F53;&#x57FA;&#x56E0;&#x7EC4;&#x6D4B;&#x5E8F;&#x3002;

We have adapted a solution hybrid selection protocol to enrich pathogen DNA in clinical samples dominated by human genetic material. Using mock mixtures of human and Plasmodium falciparum malaria parasite DNA as well as clinical samples from infected patients, we demonstrate an average of approximately 40-fold enrichment of parasite DNA after hybrid selection. This approach will enable efficient genome sequencing of pathogens from clinical samples, as well as sequencing of endosymbiotic organisms such as Wolbachia that live inside diverse metazoan phyla.

Hybrid selection for sequencing pathogen genomes from clinical samples.

Nous avons adapt&eacute; un protocole de s&eacute;lection de solution hybride pour enrichir le pathog&egrave;ne ADN dans les &eacute;chantillons cliniques domin&eacute;s par le mat&eacute;riel g&eacute;n&eacute;tique humain. &Agrave; l&#39;aide de m&eacute;langes de simulacres de l&#39;homme et le parasite Plasmodium falciparum malaria ADN ainsi que des &eacute;chantillons cliniques de patients infect&eacute;s, nous d&eacute;montrons une moyenne d&#39;environ 40 fois l&#39;enrichissement de l&#39;ADN du parasite apr&egrave;s s&eacute;lection de l&#39;hybride. Cette approche permettra le s&eacute;quen&ccedil;age du g&eacute;nome efficace des agents pathog&egrave;nes provenant d&#39;&eacute;chantillons cliniques, ainsi que le s&eacute;quen&ccedil;age d&#39;endosymbiotique des organismes tels que les Wolbachia qui vivent &agrave; l&#39;int&eacute;rieur de divers phyla de m&eacute;tazoaires.

S&eacute;lection d&#39;hybrides de s&eacute;quen&ccedil;age des g&eacute;nomes de pathog&egrave;ne provenant d&#39;&eacute;chantillons cliniques.

Wir haben eine L&ouml;sung Hybrid-Auswahl-Protokoll um Erreger DNA in klinischen Proben von menschlichen genetischen Materials dominiert bereichern angepasst. Mit gespielter Mischungen von Human- und Plasmodium Falciparum Malaria-Parasiten DNA sowie klinischen Proben von infizierten Patienten, zeigen wir einen Durchschnitt von ungef&auml;hr 40-fold Bereicherung der Parasiten-DNA nach Hybrid-Auswahl. Dieser Ansatz erm&ouml;glicht effiziente Genomsequenzierung der Erreger von klinischen Proben sowie Sequenzierung Endosymbiotic Organismen wie Wolbachia, die in vielf&auml;ltigen indem St&auml;mme Leben.

Hybrid-Auswahl f&uuml;r Pathogen Genome von klinischen Proben.

Abbiamo adattato un protocollo di selezione soluzione ibrida per arricchire l&#39;agente patogeno del DNA in campioni clinici dominato da materiale genetico umano. Utilizzando miscele finti di umani e parassita della malaria Plasmodium falciparum del DNA, nonch&eacute; campioni clinici da pazienti infetti, dimostriamo una media di circa 40-fold arricchimento di DNA parassita dopo selezione ibrido. Questo approccio consentir&agrave; il sequenziamento del genoma efficiente di agenti patogeni da campioni clinici, cos&igrave; come il sequenziamento di endosymbiotic organismi come Wolbachia che vivono all&#39;interno di diversi phyla di metazoi.

Selezione di ibridi per il sequenziamento dei genomi di patogeni da campioni clinici.

&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x4EBA;&#x9593;&#x306E;&#x907A;&#x4F1D;&#x7269;&#x8CEA;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x652F;&#x914D;&#x3057;&#x305F;&#x81E8;&#x5E8A;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306B;&#x304A;&#x3051;&#x308B; DNA &#x75C5;&#x539F;&#x4F53;&#x3092;&#x8C4A;&#x304B;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x30BD;&#x30EA;&#x30E5;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3; &#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x9078;&#x629E;&#x30D7;&#x30ED;&#x30C8;&#x30B3;&#x30EB;&#x3092;&#x9069;&#x5FDC;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x4EBA;&#x9593;&#x3068;&#x30DE;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x539F;&#x866B; falciparum &#x30DE;&#x30E9;&#x30EA;&#x30A2;&#x539F;&#x866B; DNA &#x3068;&#x3057;&#x3066;&#x611F;&#x67D3;&#x3057;&#x305F;&#x60A3;&#x8005;&#x304B;&#x3089;&#x81E8;&#x5E8A;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x306E;&#x30E2;&#x30C3;&#x30AF;&#x306E;&#x6DF7;&#x5408;&#x7269;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x3001;&#x6211;&#x3005; &#x306F;&#x5E73;&#x5747;&#x7D04; 40-fold &#x306E;&#x6FC3;&#x7E2E;&#x5BC4;&#x751F;&#x866B; DNA &#x306E;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x9078;&#x629E;&#x5F8C;&#x3092;&#x793A;&#x3057;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306F;&#x3001;&#x81E8;&#x5E8A;&#x691C;&#x4F53;&#x304B;&#x3089;&#x306E;&#x75C5;&#x539F;&#x4F53;&#x306E;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x914D;&#x5217;&#x6C7A;&#x5B9A;&#x3060;&#x3051;&#x3067;&#x306A;&#x304F;&#x3001;&#x591A;&#x69D8;&#x306A;&#x5F8C;&#x751F;&#x52D5;&#x7269;&#x9580;&#x306E;&#x5185;&#x5074;&#x306B;&#x4F4F;&#x3093;&#x3067;&#x3044;&#x308B;&#x5171;&#x751F;&#x751F;&#x7269;&#x30DC;&#x30EB;&#x30D0;&#x30AD;&#x30A2;&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x30B7;&#x30FC;&#x30B1;&#x30F3;&#x30B9;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x81E8;&#x5E8A;&#x8A66;&#x6599;&#x304B;&#x3089;&#x75C5;&#x539F;&#x4F53;&#x30B2;&#x30CE;&#x30E0;&#x3092;&#x914D;&#x5217;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30CF;&#x30A4;&#x30D6;&#x30EA;&#x30C3;&#x30C9;&#x9078;&#x629E;&#x3002;

&#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC778;&#xAC04;&#xC758; &#xC720;&#xC804; &#xBB3C;&#xC9C8;&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xC9C0;&#xBC30; &#xD558;&#xB294; &#xC784;&#xC0C1; &#xC0D8;&#xD50C;&#xC5D0;&#xC11C; DNA&#xB97C; &#xBCD1;&#xC6D0; &#xCCB4;&#xB97C; &#xD48D;&#xBD80; &#xD558; &#xAC8C; &#xD558;&#xB294; &#xC194;&#xB8E8;&#xC158; &#xD558;&#xC774;&#xBE0C;&#xB9AC;&#xB4DC; &#xC120;&#xD0DD; &#xD504;&#xB85C;&#xD1A0;&#xCF5C;&#xC744; &#xC801;&#xC751; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xD558;&#xC774;&#xBE0C;&#xB9AC;&#xB4DC; &#xC120;&#xD0DD; &#xD6C4; &#xAE30;&#xC0DD;&#xCDA9; DNA&#xC758; &#xC57D; 40-fold &#xB18D;&#xCD95;&#xC758; &#xD3C9;&#xADE0; &#xC778;&#xAC04; Plasmodium falciparum &#xB9D0;&#xB77C;&#xB9AC;&#xC544; &#xAE30;&#xC0DD;&#xCDA9; DNA &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xAC10;&#xC5FC; &#xB41C; &#xD658;&#xC790;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC784;&#xC0C1; &#xC0D8;&#xD50C; &#xBAA8;&#xC758; &#xD63C;&#xD569;&#xBB3C;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBCF4;&#xC5EC; &#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC5D0;&#xB294; &#xC784;&#xC0C1; &#xC0D8;&#xD50C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCD1;&#xC6D0; &#xCCB4;&#xC758; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xAC8C;&#xB188; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1; &#xBFD0;&#xB9CC; &#xC544;&#xB2C8;&#xB77C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; metazoan phyla &#xB0B4;&#xBD80; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; Wolbachia &#xAC19;&#xC740; endosymbiotic &#xC0DD;&#xBB3C;&#xC758; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1; &#xC218; &#xC788;&#xAC8C; &#xB41C;&#xB2E4;.

&#xC784;&#xC0C1; &#xC0D8;&#xD50C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCD1;&#xC6D0; &#xCCB4; &#xAC8C;&#xB188; &#xC2DC;&#xD000;&#xC2F1;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD558;&#xC774;&#xBE0C;&#xB9AC;&#xB4DC; &#xC120;&#xD0DD;.

Hemos adaptado un protocolo de selecci&oacute;n de soluci&oacute;n h&iacute;brida para enriquecer el pat&oacute;geno de ADN en muestras cl&iacute;nicas, dominado por el material gen&eacute;tico humano. Utilizando mezclas simulacros de humanos y par&aacute;sito de la malaria Plasmodium falciparum ADN, as&iacute; como muestras cl&iacute;nicas de pacientes infectados, demostramos un promedio de aproximadamente 40-fold enriquecimiento del ADN del par&aacute;sito despu&eacute;s de selecci&oacute;n de h&iacute;bridos. Este enfoque permitir&aacute; la secuenciaci&oacute;n del genoma eficiente de pat&oacute;genos de muestras cl&iacute;nicas, as&iacute; como la secuencia de organismos endosimbi&oacute;tica como Wolbachia que viven dentro de diverso phyla metazoarios.

Selecci&oacute;n de h&iacute;bridos para secuenciar genomas de pat&oacute;geno de muestras cl&iacute;nicas.

Learning to read and write the transcriptional regulatory code is of central importance to progress in genetic analysis and engineering. Here we describe a massively parallel reporter assay (MPRA) that facilitates the systematic dissection of transcriptional regulatory elements. In MPRA, microarray-synthesized DNA regulatory elements and unique sequence tags are cloned into plasmids to generate a library of reporter constructs. These constructs are transfected into cells and tag expression is assayed by high-throughput sequencing. We apply MPRA to compare >27,000 variants of two inducible enhancers in human cells: a synthetic cAMP-regulated enhancer and the virus-inducible interferon-β enhancer. We first show that the resulting data define accurate maps of functional transcription factor binding sites in both enhancers at single-nucleotide resolution. We then use the data to train quantitative sequence-activity models (QSAMs) of the two enhancers. We show that QSAMs from two cellular states can be combined to design enhancer variants that optimize potentially conflicting objectives, such as maximizing induced activity while minimizing basal activity.

Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.

Genome-wide chromatin annotations have permitted the mapping of putative regulatory elements across multiple human cell types. However, their experimental dissection by directed regulatory motif disruption has remained unfeasible at the genome scale. Here, we use a massively parallel reporter assay (MPRA) to measure the transcriptional levels induced by 145-bp DNA segments centered on evolutionarily conserved regulatory motif instances within enhancer chromatin states. We select five predicted activators (HNF1, HNF4, FOXA, GATA, NFE2L2) and two predicted repressors (GFI1, ZFP161) and measure reporter expression in erythroleukemia (K562) and liver carcinoma (HepG2) cell lines. We test 2104 wild-type sequences and 3314 engineered enhancer variants containing targeted motif disruptions, each using 10 barcode tags and two replicates. The resulting data strongly confirm the enhancer activity and cell-type specificity of enhancer chromatin states, the ability of 145-bp segments to recapitulate both, the necessary role of regulatory motifs in enhancer function, and the complementary roles of activator and repressor motifs. We find statistically robust evidence that (1) disrupting the predicted activator motifs abolishes enhancer function, while silent or motif-improving changes maintain enhancer activity; (2) evolutionary conservation, nucleosome exclusion, binding of other factors, and strength of the motif match are predictive of enhancer activity; (3) scrambling repressor motifs leads to aberrant reporter expression in cell lines where the enhancers are usually inactive. Our results suggest a general strategy for deciphering cis-regulatory elements by systematic large-scale manipulation and provide quantitative enhancer activity measurements across thousands of constructs that can be mined to develop predictive models of gene expression.

Systematic dissection of regulatory motifs in 2000 predicted human enhancers using a massively parallel reporter assay.

Deep mutational scanning has emerged as a promising tool for mapping sequence-activity relationships in proteins, ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid. In this approach, diverse variants of a sequence of interest are first ranked according to their activities in a relevant assay, and this ranking is then used to infer the shape of the fitness landscape around the wild-type sequence. Little is currently known, however, about the degree to which such fitness landscapes are dependent on the specific assay conditions from which they are inferred. To explore this issue, we performed comprehensive single-substitution mutational scanning of APH(3')II, a Tn5 transposon-derived kinase that confers resistance to aminoglycoside antibiotics, in Escherichia coli under selection with each of six structurally diverse antibiotics at a range of inhibitory concentrations. We found that the resulting local fitness landscapes showed significant dependence on both antibiotic structure and concentration, and that this dependence can be exploited to guide protein engineering. Specifically, we found that differential analysis of fitness landscapes allowed us to generate synthetic APH(3')II variants with orthogonal substrate specificities.

Article	Year
Genome sequence, comparative analysis and haplotype structure of the domestic dog. Nature\| PubMed ID: 16341006	2005
Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nature biotechnology\| PubMed ID: 19182786	2009
Targeted next-generation sequencing of a cancer transcriptome enhances detection of sequence variants and novel fusion transcripts. Genome biology\| PubMed ID: 19835606	2009
Targeted exon sequencing by in-solution hybrid selection. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]\| PubMed ID: 20582916	2010
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Comprehensive mutational scanning of a kinase in vivo reveals substrate-dependent fitness landscapes. Nucleic acids research\| PubMed ID: 24914046	2014

Alexandre Melnikov

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